Sh-RNAi对NG108-15细胞膜受体基因TNF-R1的干扰

夏九成 龙廷 秦达念

(1攀枝花学院生物与化学工程学院，四川 攀枝花 617000；2汕头大学医学院生理教研室)

肿瘤坏死因子(TNF)-α通常是由激活的免疫系统所产生，对许多肿瘤细胞具有明显的细胞毒性，可在特定动物模型中引起肿瘤的消退。通常，TNF-α被认为是促炎性因子诱导细胞凋亡〔1，2〕。但最近却发现在特定病理及生理条件下，TNF-α的功能具有双向性，即有时诱导细胞组织的坏死凋亡，有时则是促进组织细胞的再生〔3，4〕。组织和细胞的类型、TNF-α受体的构成、TNF-α作用的时机及作用时间的长短都可以影响TNF-α在体内的作用方向和结果。TNF-α的信号传导依赖于细胞膜上两个截然不同的受体发挥作用。分别是TNF受体(TNF-R)1(55 kD)和TNF-R2(75 kD)。TNF-R1在大多数组织细胞内稳定表达，而TNF-R2主要在免疫组织和细胞内进行可调控性表达。 在多数情况下，TNF-R1是主要的TNF-α信号介导因子，可以介导各类炎症反应，从而引起机体产生病变〔4～6〕。

NG108-15细胞株是一个由小鼠神经母细胞瘤与大鼠神经胶质瘤细胞杂交后获得细胞株系〔7〕。其中，小分子化合物双丁酰环磷酸腺苷(dc-AMP)可以诱导NG108-15细胞分化形成成熟的神经元细胞。许多研究机构均采用该细胞系作为细胞模型来研究神经元的功能变化〔8，9〕。

本研究针对小鼠TNF-R1基因序列的不同区段，设计了4组候选sh-RNAi干扰序列试图敲低TNF-R1在NG108-15细胞内的表达，以确定最佳的sh-RNAi干扰序列〔10～14〕。并研究sh-RNAi干扰序列对NG108-15细胞内的阿黑皮素原(POMC)、神经肽(NP)Y、刺鼠基因相关蛋白(AGRP)神经内分泌基因是否存在干扰〔15，16〕。

1 材料与方法

1.1实验材料 NG108-15细胞系，PIPZ-1质粒载体，DH5a大肠杆菌。

1.2实验试剂与药品 DMEM培养基、胎牛血清、双抗(青霉素+链霉素，Gibco),dc-AMP、氨苄霉素、嘌呤霉素(Sigma)，RNA提取试剂盒、RNA逆转录试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒(Takara)，Xhol和EcoR-1限制性内切酶，T4DNA连接酶(NEB)，转染试剂脂质体Lipo2000(Invitrgen)，质粒提取试剂盒，DNA分子marker(天根生物)，LB固体培养基，LB液体培养基，琼脂糖，溴化乙锭，大肠杆菌感受态细胞制备试剂盒(生工)。

1.3实验方法

1.3.1NG108-15细胞的分化培养 将NG108-15细胞按1×104细胞/ml密度接种到直径为35 mm的细胞培养板上，加入1 ml DMEM培养基进行培养。培养2 d后，加入含1 mmol/L dc-AMP的DMEM培养基进行分化培养。此后每隔3 d换液一次，7 d后待细胞完全分化出细胞突触后，收集所培养细胞待用。

1.3.2针对TNF-R1设计的sh-RNAi干扰序列 sh-RNAi干扰序列均根据小鼠TNF-R1基因的mRNA(NM_011609.4)，利用siDirect软件来设计，sh-0为空白对照，空载质粒；Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-4具体序列见表1。

表1 小鼠TNF-R1的sh-RNAi干扰序列

1.3.3sh-RNAi重组质粒载体的构建 载体(PIPZ-1，图1)由汕头大学医学院顾巍教授实验室惠赠。将PIPZ-1质粒通过转染试剂转入DH5a大肠杆菌进行质粒的扩增，并通过质粒提取试剂盒提取质粒放入-20℃冰箱保存备用。将提取纯化的质粒，利用Xhol 和EcoR-1(NEB)限制性内切酶进行双酶切，以保证干扰序列的定向插入。然后利用T4DNA将干扰序列连接到PIPZ-1载体上。

1.3.4sh-RNAi重组DNA转入NG108-15细胞 当NG108-15细胞生长密度达到70%～90%后，将重组sh-RNAi的载体分子利用Lipo2000(Invitrogen)将其转入受体细胞内。利用5 μg/ml嘌呤霉素(Solarbio)筛选获得转化细胞。

1.3.5TNF-R1基因表达的荧光定量检测 用100 pg/ml TNF-α孵育转化细胞12 h后，收集每一个培养孔中的转化细胞，加入0.5 ml的RNA提取试剂(Takara)提取总RNA，用50 μl超纯水稀释后-70℃保存。cDNA的合成利用逆转录试剂盒(Takara)完成，之后的PCR在荧光定量PCR仪(ABI7500)上进行，扩增程序为95℃，5 s；60℃，34 s；40个循环，扩增试剂为SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara)。扩增引物序列见表2，试验结果用2-ΔΔCt相对定量法进行数据分析。

图1 PIPZ-1载体的结构(8 075 bp)

表2 荧光定量PCR的引物序列

1.3.6POMC、NPY、AGRP神经内分泌基因受干扰的检测 在确认最佳的TNF-R1干扰系列后，将其导入成熟的NG108-15细胞中，利用荧光定量PCR检测此干扰系列对神经内分泌基因POMC、NPY和AGRP是否存在干扰效应。基因引物序列见表3。

表3 POMC、NPY和AGRP基因的引物序列

2 结 果

2.1NG108-15细胞的诱导分化 NG108-15细胞出现分化，部分细胞间出现突触联系，说明具有了神经元细胞的形态特征。见图2。

图2 NG108-15细胞的形态特征(×100)

2.2sh-RNAi干扰TNF-R1 Sh-1、Sh-2、Sh-3、Sh-4、Sh-0干扰序列TNF-R1相对表达量分别为：0.445±0.32、0.679±0.14、0.834±0.41、0.561±0.26、1.000±0.24。Sh-1干扰序列对TNF-R1基因具有最好的干扰效果，可将其作为本试验的最佳干扰序列进行后续的干扰试验。

2.3Sh-1干扰序列对POMC、AGRP、NPY基因的表达影响 Sh-1干扰序列对POMC、AGRP和NPY基因的表达均有显著影响，尤其对AGRP基因的影响最显著(调低45.4%)。见表4。

表4 sh-1干扰序列对POMC、NPY和AGRP基因表达的影响

3 讨 论

本研究根据小鼠TNF-R1基因的mRNA序列设计了4组sh-RNAi干扰序列导入分化后的NG108-15细胞。从干扰结果来看，sh-1的干扰结果最佳。而sh-1干扰序列针对的靶区是TNF-R1受体的439～461位，此序列是TNF-R1受体的膜外半胱氨酸富集区(CRD)1。该靶区对于TNF-α与受体TNF-R1的有效结合，并对信号转导起到关键作用〔4，6，10〕。同时Sh-1通过对TNF-R1的干扰，最终对下游的其他神经内分泌基因也可产生影响，使POMC、NPY和AGRP基因的表达也有不同程度降低。由此说明，对于由于细胞炎性因子TNF-α诱导的下丘脑神经内分泌疾病，可以考虑通过sh-RNAi干扰的方法降低相应的炎症反应〔3，4，10，13〕。