WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表达及其与预后的关系*

冯砚平，王 楠，王伟佳

广东省中山市人民医院检验医学中心，广东中山 528400

急性髓系白血病是一类高度异质性疾病，主要特征为髓系原始细胞克隆性恶性增殖，危害较大，病死率较高。基因检测有助于预防、避免重大疾病的发生，发现个体基因缺陷，制订临床治疗方案[1-2]。Wilms基因(WT1基因)最早在Wilms瘤中被发现，相对分子质量约为50×103，位于人类染色体11p13，与瘤体病变密切相关。WT1基因在白血病中有较高水平的表达，被称为“泛白血病”基因标志，与白血病发生、发展以及预后均密切相关[3]；裸角质膜同源蛋白(NKD1)基因属于Wnt/β-Catenin信号通路抑制物，与肿瘤细胞的多项生物学功能有关，也能在正常组织中表达，但表达水平较低[4]。本研究分析了WT1、NKD1基因在急性髓系白血病中的表达情况，旨在探讨WT1、NKD1基因表达与急性髓系白血病预后的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2018年2月至2019年6月本院收治的100例急性髓系白血病患者纳入研究作为观察组，患者均符合《成人急性髓系白血病中国诊疗指南(2017年版)》[5]诊断标准。观察组患者年龄35～72岁，平均(51.68±12.14)岁；男性46例，女性54例；FAB分型：16例M1型，28例M2型，24例M3型，22例M4型，10例M5型；ET0分型：15例突变型，85例野生型；核型：65例t(15；17)型，35例t(8；21)型。另外，选取同期于本院治疗的造血系统非恶性肿瘤(缺铁性贫血)患者100例作为对照组。对照组患者年龄34～71岁，平均(51.49±12.13)岁；男性47例，女性53例。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已经本院伦理委员会批准。纳入研究的患者均同意接受12个月随访，依从性、配合度较高，已签署书面知情同意书。排除标准：沟通、交流障碍者；合并恶性肿瘤，预计生存时间≤1个月者。

1.2方法

1.2.1WT1的检测及分析 (1)抽取受检者2 mL抗凝骨髓液，分离单个核细胞，PBS洗2遍，吹打悬浮(运用适量PBS)，抽取0.5 mL浸泡于Trizol中摇匀，放于冰箱(-80 ℃)内保存；制作2张骨髓涂片。(2)将提取成功的单个核细胞总RNA放入冰箱内(-80 ℃)保存。(3)反转录PCR(RT-PCR)：按照说明书配制cDNA反应体系20 μL，PCR扩增反应体系25 μL；WT1基因表达水平以WT1与GAPDH灰度值的比值表示。

1.2.2NKD1的检测及分析 使用美国ABI公司7300型号荧光定量扩增仪进行反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测，反应体系的配制、反应条件、引物设计、基因相对表达水平的计算参考文献[6]。

1.2.3治疗方法 对于确诊的急性髓系白血病患者，采用柔红霉素联合阿糖胞苷方案(DA方案)进行化疗，第1～3天静脉滴注45 mg/m2柔红霉素(国药准字H33020925，瀚晖制药有限公司)或8 mg/m2去甲氧柔红霉素(国药准字H20050145，瀚晖制药有限公司)，第1～7天静脉滴注150 mg/m2阿糖胞苷(国药准字H23021805，国药一心制药有限公司)。

1.3观察指标 比较两组NKD1、WT1基因表达情况；分析不同性别、年龄、FAB分型、ET0分型、核型的急性髓系白血病患者WT1和NKD1基因表达情况；使用受试者操作特征曲线(ROC曲线)分析WT1、NKD1基因用于急性髓系白血病诊断的价值；对急性髓系白血病患者进行12个月随访，统计患者12个月内的生存率以及随访期间平均生存时间，同时分别统计NKD1、WT1基因不同表达程度(高表达和正常表达)患者的生存率和生存时间；分析WT1、NKD1基因表达与生存时间、生存率的相关性。

2 结 果

2.1两组间基因表达情况的比较 观察组WT1基因表达水平(1.13±0.19)高于对照组(0.06±0.01)，差异有统计学意义(t=56.238,P<0.001)；观察组NKD1基因表达水平(0.86±0.15)高于对照组(0.04±0.01)，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2不同临床特征急性髓系白血病患者的WT1、NKD1基因表达水平 不同性别、年龄、FAB分型、ET0分型、核型的急性髓系白血病患者间比较，WT1和NKD1基因表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同临床特征的急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表达水平的比较

续表1 不同临床特征的急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表达水平的比较

2.3WT1、NKD1基因的诊断价值分析 WT1基因检测以相对表达水平0.88作为诊断界值，>0.88标记为高表达，观察组100例患者中90例出现高表达。NKD1基因检测以相对表达水平0.52作为诊断界值，>0.52标记为高表达，观察组100例患者中92例出现高表达。ROC曲线分析显示，WT1基因检测用于急性髓系白血病诊断的AUC为0.979，NKD1基因检测的AUC为0.984，两者均具有较高的诊断价值。见表2。

表2 WT1、NKD1基因检测的ROC曲线分析

2.4患者生存率和生存时间的分析 观察组100例患者接受化疗干预后，总生存率为88.00%(88/100)，平均生存时间为(10.42±2.69)月。不同基因表达程度患者的生存率和生存时间见表3。

表3 对比不同基因表达情况的生存率和生存时间

2.5WT1、NKD1基因表达与急性髓系白血病患者生存时间、生存率的关系 WT1、NKD1基因表达水平与急性髓系白血病患者生存率无显著相关性(P>0.05)，但均与急性髓系白血病患者生存时间呈正相关(r=0.417、0.492，P<0.001)，WT1基因和NKD1基因表达水平呈正相关(r=0.643，P<0.001)。

3 讨 论

急性髓系白血病是一类高度异质性疾病，根据基因突变和细胞遗传学情况，可分为3个危险分层，为了准确了解病变发生、发展情况，需注重临床检测工作，从而合理制订治疗方案[7-8]。WT1是一种抑癌基因，编码产物是转录因子，最早从Wilms瘤细胞中分离出来，编码的蛋白含锌指状多肽，在肿瘤患者骨髓和外周血中高表达，而在健康人群中仅存在微量表达或不表达[9-10]。本研究中，观察组WT1基因表达水平高于对照组。

NKD1基因是Wnt/β-Catenin信号通路的经典抑制物，参与调节细胞迁移、分化、增殖等生物学过程，影响造血干细胞衰老过程，且可调控骨生长和骨量生长[6]。本研究中，观察组NKD1基因表达水平高于对照组。当机体出现异常时，NKD1基因表达上调，可直接激活靶基因转录，影响细胞衰老、增殖、生长等过程，NKD1基因表达上调可能参与了急性髓系白血病的发生、发展。对比了不同临床特征急性髓系白血病患者WT1、NKD1基因表达情况，结果均无明显差异。因为WT1、NKD1基因仅受启动子区域高甲基化调控影响，而性别、年龄、FAB分型、ET0分型、核型均不是其表达水平的影响因素[11]。此外，本研究发现WT1、NKD1基因表达水平的检测用于急性髓系白血病诊断均有较高价值，可作为辅助诊断的分子标志物[12]，但由于本次样本量较少，该结论还有待进一步的研究来验证。

许晶等[13]报道，WT1基因与急性髓系白血病预后具有一定相关性。本研究中，WT1、NKD1基因表达水平均与急性髓系白血病患者生存时间呈正相关，说明WT1、NKD1基因表达水平能够一定程度地预测治疗效果。WT1基因在急性髓系白血病患者中具有较高的表达水平，主要靶基因包括细胞周期负调控基因、Wnt信号途径基因、MAPK信号途径基因等，参与细胞死亡、代谢、分化、生长，故在急性髓系白血病患者发生、发展、预后中具有一定作用[14]。NKD1可抑制Wnt信号通路活化，是Wnt信号通路重要的负向调节因子，当机体出现病变时，NKD1基因表达水平可明显升高，与病变程度、预后相关[15]。

总而言之，WT1基因和NKD1基因表达水平呈正相关，可作为急性髓系白血病患者预后评判的重要指标，且与患者生存时间呈正相关，可作为免疫治疗的靶点。