精浆抗苗勒管激素水平与体外受精周期中受精率的相关性研究*

冼英杰，陈润强，李付广，乔 静，周秀琴，冯 玲，邱佩嫦，陈彩蓉

广州医科大学附属第六医院/广东省清远市人民医院生殖医学中心，广东清远 511500

近年我国不孕不育夫妇的比例逐年上升，体外受精(IVF)和胚胎移植(ET)技术目前已成为不孕不育患者解决生育问题的常规有效手段。在诊疗过程中，对IVF受精率的预测是其中一个重要环节，目前临床医生主要依据精液参数对患者受精率进行评估，为患者制订合理的助孕方案以获得更好的临床结局。虽然IVF技术日益进步，但IVF受精障碍仍难以避免，有5%～15%的IVF周期会发生完全受精失败或低受精[1-2]，特别是当无胚胎可用时，不仅加重患者经济及身心负担，而且增加临床医生和胚胎学家的压力。因此，目前这种利用精液参数来预测精子受精能力的方法存在极大的局限性，为了最大限度保证IVF能产生理想数量和质量的胚胎，有效避免完全受精失败或受精率低下，有必要寻找单一或综合的实验室检测指标以更精确地预测IVF受精结局。精浆抗苗勒管激素(AMH)是转化生长因子β超家族成员之一，由睾丸生精上皮支持细胞在卵泡刺激素(FSH)刺激下产生[3]，分泌过程受雄激素、促性腺激素的调节和支持细胞附近的生殖细胞分化程度的影响[4-5]。成年男性的AMH只有在支持细胞上产生并释放至输精管，文献报道精浆AMH与睾丸生精上皮功能及精子形成的数量和质量密切相关[6-7]。最近，有研究指出精浆AMH可以作为预测IVF受精率的实验室指标[8]，但此类研究报道极少，其对受精率的预测价值仍不明确。因此，本研究分析了接受IVF治疗的不孕不育男性患者精浆AMH水平与受精率之间的相关性，利用ROC曲线评估其对受精率的预测能力，以期为临床预测IVF结局和选择受精方法提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究选取了2018-2020年在本院生殖中心行常规IVF治疗的不孕不育夫妇170对进行前瞻性研究，男女双方年龄均≤38岁，女方卵巢功能正常且血清AMH≥1.1 ng/mL，基础窦卵泡(AFC)≥5个，基础FSH<10.0 ng/mL，体质量指数(BMI)18.0～24.0 kg/m2，因输卵管因素采用长方案和拮抗剂方案进行控制性促排卵，获卵数≥5个。男方精液分析按世界卫生组织(WHO)第五版标准进行，正常形态精子均≥4%，将170对夫妇根据男方精液参数分为3组，正常精子组(n=55)：精子浓度(15～<50)×106/mL，前向运动精子比例(PR)≥32%；高精子总数组(n=46)：精子浓度≥50×106/mL，PR≥32%；弱精子组(n=69)：精子浓度<15×106/mL，PR为>5%～<32%。剔除标准：不明原因的不育患者。本研究经医院伦理委员会批准(编号QPH-IRB-A0118)，患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集和精子分析 男方禁欲2～7 d，取卵日通过手淫收集精液到无毒无菌杯中。每1次采集的精液标本分为3份，分别用于精液分析、精浆分离后AMH检测及IVF的精液优选。精液标本完全液化后在60 min内处理及分析，浓度和活力分析使用西班牙Microptic公司SCA-5精液分析仪，精子形态学分析采用Diff-Quik快速染色法在光学显微镜1 000倍下进行检测。

1.2.2精浆AMH检测 取200 μL精液高速离心15 min，吸取25 μL精浆使用商品化的定量检测试剂盒进行AMH检测(酶联免疫吸附测定法，广州康润生物科技有限公司)，线性检测范围为0.06～18.00 ng/mL，超出检测上限，则稀释后重新检测；低于检测下限，则按0.06 ng/mL计算。

1.2.3控制性促排卵方案 促排卵方案有长方案和拮抗剂方案两种。长方案：前一月经周期20～24 d给促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)0.94～1.88 mg，达到垂体降调节标准后给予促性腺激素(Gn)启动；拮抗剂方案：于月经周期第2～3天开始，起始剂量同长方案，Gn启动第5或6天开始使用一次促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRH-ant) 0.25 mg/d，持续至注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)日。当优势卵泡达到扳机标准时，停用Gn，当晚注射HCG，34～36 h后临床医生在B超引导下经阴道穿刺取卵。

1.2.4IVF和胚胎观察 获得的卵子在培养箱培养3～4 h后采用过夜受精方法进行IVF，受精液精子终浓度为10万条/毫升。受精后16～18 h观察原核(PN)，2PN为正常受精，并可见第二极体，多PN或1PN为异常受精。正常受精卵与异常受精卵在所有卵子当中的比率即为受精率。

2 结 果

2.1各组夫妇女方基本资料的比较 各组夫妇间女方各项基本资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组夫妇女方基本资料比较

2.2各组夫妇男方基本资料及IVF受精情况的比较 正常精子组、高精子总数组和弱精子组的男方年龄、精液量和精浆AMH差异均无统计学意义(P>0.05)；正常精子组和高精子总数组的IVF受精率、完全受精失败及低受精的比例差异无统计学意义(P>0.05)；弱精子组与其他两组相比，总精子数、精子浓度、PR、总活力、IVF受精率和完全受精失败及低受精的比例差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组男方基本资料及IVF受精情况比较

2.3整体研究人群和各组中男方年龄、精浆AMH、精液参数与IVF受精率之间的相关性 整体研究人群中男方总精子数、精子浓度、PR、总活力、精浆AMH均与受精率呈正相关(r=0.460、0.566、0.308、0.346、0.478，P<0.05)；在弱精子组，精浆AMH及PR与受精率呈正相关(r=0.299、0.266，P<0.05)。见表3。

表3 整体研究人群和各组男方精浆AMH及精液参数与IVF受精率之间的相关系数(r)

2.4整体研究人群中精浆AMH及精液参数对IVF受精率的预测价值 精浆AMH：曲线下面积(AUC)为0.647(灵敏度83.3%，特异度42.3%，截断点0.252 ng/mL，P=0.018)；总精子数：AUC=0.539(灵敏度63.9%，特异度46.2%，截断点63.9×106/次，P=0.527)；精子浓度：AUC=0.595(灵敏度64.4%，特异度55.4%，截断点39.5×106/mL，P=0.033)；PR：AUC=0.599(灵敏度90.3%，特异度30.8%，截断点20.5%，P=0.109)；总活力：AUC=0.606(灵敏度66.7%，特异度53.8%，截断点56.5%，P=0.085)；精浆AMH对IVF受精率的预测价值较高。

2.5弱精子组中精浆AMH及PR对IVF受精率的预测价值 精浆AMH：AUC=0.665(灵敏度60.0%，特异度72.7%，截断点1.762 ng/mL，P=0.023)；PR：AUC=0.511(灵敏度76.0%，特异度34.1%，截断点20.5%，P=0.881)。精浆AMH对IVF受精率的预测价值优于PR。

2.6弱精子组精浆AMH≥1.762 ng/mL与<1.762 ng/mL患者的受精情况比较 与精浆AMH≥1.762 ng/mL的患者相比，精浆AMH<1.762 ng/mL患者的受精率显著降低(93.15%vs.70.92%P<0.01)，完全受精失败及低受精比例明显升高[0vs.15.91%,P<0.01]。

3 讨 论

男性AMH是睾丸生精上皮支持细胞分泌的细胞因子，对男性生殖系统的分化、发育及成熟发挥重要的作用。AMH是精子形成的标志物，深度参与人类生殖的过程，是男性不育的重要影响因子之一。有学者对少、弱精子症患者接受重组人卵泡刺激素(rhFSH)治疗是否有反应性进行研究，结果显示基础精浆AMH水平高的患者对治疗的反应性较AMH水平低的患者高，治疗后其受精率及妊娠率显著升高[9]。有研究认为，AMH可能存在保护精子免受损害的机制，可以作为少、弱精子症患者冷冻精液复苏后精子复苏率及精子活力的预测指标[10]。王彦飞等[8]报道，精浆AMH与少、弱精子症患者的IVF受精率呈正相关，对受精率的预测价值高于精液参数。本研究显示，在整体研究人群中，精浆AMH和精液参数如总精子数、精子浓度、PR及总活力均与IVF受精率呈正相关，精浆AMH的AUC大于各精液参数的AUC，表明精浆AMH对IVF受精率的预测有较高的价值。正常精子组和高精子总数组精浆AMH及精液参数与受精率没有明显相关性，可能是由于这两组受精率都比较高，没有发生完全受精失败及低受精，因此相关性不明显。但在弱精子组，精浆AMH及PR与受精率呈正相关，精浆AMH的AUC大于PR，表明弱精子症患者精浆AMH对IVF受精率的预测价值优于PR，与王彦飞等[8]的研究结论一致。精子和卵子在体外结合受精是一个复杂的过程，快速前向运动精子是受精的主力，而在弱精子组精浆AMH水平与IVF受精率呈正相关，提示在弱精子症患者中AMH可能以某种形式参与了精子运动性的调节。

目前主要的常规IVF受精方法是过夜受精，但其较高的完全受精失败及低受精风险使医生及胚胎学家在临床应用上仍较谨慎。而另一种受精方法——短时受精，已有大量研究数据证实其可以有效避免完全受精失败的发生[11]，但是早拆卵的操作及补救卵胞质内单精子注射(ICSI)可能会引起多精受精增加[12-13]，且其较高的早补救率不仅使患者经济和精神压力增大，同时也会增加实验室胚胎学家的工作负担和压力，限制了其在临床上的大规模应用。本研究显示，弱精子组的受精率、完全受精失败率及低受精比例均明显低于正常精子组和高精子总数组，与文献[14-15]报道一致。其原因可能为弱精子症患者存在DNA碎片及顶体酶活性异常的精子比例增高，具备正常受精能力的精子不能达到卵子受精所需要的浓度[16-18]。正常精子组和高精子总数组的精浆AMH及精液参数与受精率无明显相关性，两组的受精率分别为91.28%和92.54%，提示本研究在对男女性患者的基本条件进行严格限制后，只要精液参数达到正常标准及以上时，单纯的精液参数或精浆AMH水平的波动不会明显影响IVF受精率。因此，对于患者夫妇中女方基础条件较好(达到本研究设定的标准)，精液参数正常的患者在IVF周期中可以使用过夜受精方式进行授精。而弱精子症患者宜使用短时受精加早拆卵技术以防止完全受精失败情况发生，特别是当精浆AMH<1.762 ng/mL时，受精率明显降低，完全受精失败及低受精比例明显升高。

本研究的优势在于前瞻性设计、样本的盲法评价及根据受精前精液参数对3组患者进行分层分析，局限性为本研究样本量较少，志愿参与者均为在生殖中心进行IVF治疗的患者，可能不代表典型的供精者。AMH测定方法仍处于发展阶段，酶联免疫吸附测定法通过标准曲线计算出的样本浓度可能低于实际数值。

综上所述，本研究表明在整体研究人群和弱精子症患者中，精浆AMH的浓度与IVF受精率有显著相关性，可用于预测精子和卵子在体外结合受精的情况。同时精浆AMH的测定可以帮助医务工作者在实际临床工作中识别风险较高的精液样本，特别是有助于弱精子症患者选择合适的受精方法。