真空冷冻干燥法制备益生菌粉的冻干保护剂配方优化

陈胜杰，高 翔，袁戎宇

(广东怡和科洁科技有限公司，广东佛山528000)

益生菌(Probiotic)，源自希腊语“forlife”［1］，即“益生菌”、“益生素”或“微生态调节剂”。2001年联合国粮食农业组织与世界卫生组织(FAO/WHO)对益生菌的最新定义为:“当摄取足够量时，可以对宿主产生一定有益作用的活的微生物的总称［2］。益生菌在预防和调理肠道疾病方面具有显著作用，足够数量的益生菌能有效定植肠道，形成菌群优势，改善肠道菌群平衡［3］。

目前国内外最常见的液体和半固体保藏方式容易造成过多的菌体失活，并对保藏温度具有较高要求，通常要在4～10℃低温保藏，限制了其产品流通［4］，真空冷冻干燥法将益生菌发酵液制成活菌制剂，是较为理想的一种保藏方法［5－6］。但由于冻干过程将活细胞暴露在额外应激压力下，引起活性损失。渗透休克、形成胞内冰晶和再结晶均能引起细胞膜损伤，造成部分活细胞死亡［7－9］。

经研究发现，植物乳杆菌具有免疫调节、抑制致病菌和维持肠道内菌群平衡的功效［10－12］，凝结芽孢杆菌凝结芽孢杆菌作为一种优质的益生菌，对人工胃液的酸性条件耐受性极强，其存活不受影响，能顺利通过胃进入肠道，从而起到益生功能［13］，酿酒酵母菌不是肠道中的固有菌群，不黏附于肠黏膜上，以活菌形式通过消化道而发挥作用，其免疫调节功能、降胆固醇以及抗氧化作用等生理功能深受关注，是人类最早利用的微生物［14］。故本研究通过单因素和正交试验，确定三株益生菌，即植物乳杆菌SC1、凝结芽孢杆菌XP2和酿酒酵母SA1等的复配冻干保护剂最优组合，致力于提高益生菌的冻干存活率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌SC1(Lactobacillus plantarum SC1，缩写L.plantarum SC1)分离自东北辣白菜汤汁中;凝结芽孢杆菌XP2(Bacillus coagulans XP2，缩写B.coagulans XP2)分离于奶牛养殖场土壤中，酿酒酵母菌SA1(Saccharomyces cerevisiae SA1，缩写S.cerevisiae SA1)购自安琪酵母科技公司并驯化，均保藏于广东怡和科洁科技有限公司菌种保藏室;脱脂乳粉 购自天猫超市旗舰店;低聚木糖 购自山东龙力生物有限公司;可溶性淀粉 购自天猫超市旗舰店;VC钠盐、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和琼脂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

ZWY－210C恒温摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;SW－CJ－1FD型单人单面净化工作台 苏州净化;FD－1D－50真空冷冻干燥机 北京博医康实仪器有限公司;752型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;pH仪 美国Mettler Toledo公司;FA1004分析天平 广州天平仪器;YXQ－50A立式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 上海博讯医疗器械有限公司。

1.2 培养基

MRS培养基:蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，硫酸镁0.58 g/L。若制作固体培养基，在此基础上加入2%的琼脂粉即可。

YPD培养基:蛋白胨20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L。若制作固体培养基，在此基础上加入2%的琼脂粉即可。

1.3 实验方法

1.3.1 单因素实验 选取对冻干后菌株存活率有影响的备选保护剂共4个，分别为脱脂乳粉［15］、低聚木糖［16］、可溶性淀粉［17］和VC钠盐［18］，其水平选择即参考相关文献，也有本实验前期预实验的数据做基础，进行合理选取，并对单因素结果进行显著性分析，根据分析结果选择合适的正交因素水平表，设计正交实验，评判标准均以对菌株存活率的正向影响为指标。

1.3.1.1 脱脂乳粉添加量对菌体存活率影响 分别取质量分数为5%、8%、12%、16%和20%的脱脂乳粉，与稳定期初期的菌体以体积比1∶1混和均匀，制成菌悬液，放入真空冻干燥机中，先在－70℃预冷冻2 h，然后调整冻干温度为－50℃、真空度10 Pa，进行冻干38 h［19］，得到益生菌冻干粉。

1.3.1.2 低聚木糖添加量对菌体存活率影响 分别取质量分数为2%、5%、8%、10%和12%的低聚木糖，与稳定期初期的菌体以体积比1∶1混和均匀，制成菌悬液，放入真空冻干燥机中，先在－70℃预冷冻2 h，然后调整冻干温度为－50℃、真空度10 Pa，冻干38 h，得到益生菌冻干粉。

1.3.1.3 可溶性淀粉添加量对菌体存活率影响 分别取质量分数为5%、8%、12%、15%和18%的可溶性淀粉，与稳定期初期的菌体以体积比1∶1混和均匀，制成菌悬液，放入真空冻干燥机中，先在－70℃预冷冻2 h，然后调整冻干温度为－50℃、真空度10 Pa，冻干38 h，得到益生菌冻干粉。

1.3.1.4 VC钠盐添加量对菌体存活率影响 分别取质量分数为1%、2%、3%、4%和5%的VC钠盐，与稳定期初期的菌体以体积比1∶1混和均匀，制成菌悬液，放入真空冻干燥机中，先在－70℃预冷冻2 h，然后调整冻干温度为－50℃、真空度10 Pa，冻干38 h，得到益生菌冻干粉。

1.3.2 正交试验 选择活菌率高的保护剂采用正交设计法进一步优化，以确定保护剂最佳组成，正交试验设计见表1，其中SC1代表植物乳杆菌SC1，XP2代表凝结芽孢杆菌XP2，SA1代表酿酒酵母SA1。

表1 益生菌冻干保护剂L9(34)正交试验因素水平Table 1 Factors and levels table of L9(34)orthogonal experiment of freeze－drying protectant for probiotic

1.3.3 细菌存活率测定 称取适量冻干粉，并向粉中加入与冻干前等体积的生理盐水(0.9%，w/v)进行复水，采用稀释涂布平板法计算活菌数，其中凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌均采用MRS固体培养基进行菌落计数［20］，酿酒酵母采用YPD固体培养基进行菌落计数。计算其存活率，平行3次试验。其中，

菌株存活率(%)=V冻干后/V冻干前×100

式中，V冻干后表示冻干后的活菌数，V冻干前表示冻干前的活菌数［21］。

1.4 数据处理

正交实验数据采用SPSS 4.0进行极差分析，每组数据三次平行，并进行显著性分析。采用Origin 8.0进行相关图形绘制。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 脱脂乳粉添加量对三种益生菌冻干存活率的影响 脱脂乳粉添加量对三种益生菌冻干存活率的影响见图1，随着脱脂乳粉浓度的增加，植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌三种菌的存活率均逐渐增加，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率保持稳定或些许下降，从成本角度考虑，真空冷冻干燥植物乳杆菌SC1(L.plantarum SC1)、凝结芽孢杆菌XP2(B.coagulans XP2)和酿酒酵母菌SA1(S.cerevisiae SA1)的冻干保护剂脱脂乳粉添加量最优值分别选择12%、8%和12%。

图1 脱脂乳粉添加量对益生菌冻干存活率的影响Fig.1 Effect of addition amount of skimmed milk powder on freeze－dried survival rate of probiotics

2.1.2 低聚木糖添加量对三种益生菌冻干存活率的影响 低聚木糖添加量对三种益生菌冻干存活率的影响，结果见图2，随着低聚木糖浓度的增加，植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌三种菌的存活率均逐渐增加，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率保持稳定或些许下降，从成本角度考虑，真空冷冻干燥植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌的冻干保护剂低聚木糖添加量最优值分别选择10%、8%和10%。

图2 低聚木糖添加量对益生菌冻干存活率的影响Fig.2 Effect of addition amount of xylo－oligosaccharide on freeze－dried survival rate of probiotics

2.1.3 可溶性淀粉添加量对三种益生菌冻干存活率的影响 可溶性淀粉添加量对三种益生菌冻干存活率的影响，结果见图3，随着可溶性淀粉浓度的增加，植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌三种菌的存活率均逐渐增加，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率保持稳定或些许下降，从成本角度考虑，真空冷冻干燥植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌的冻干保护剂可溶性淀粉添加量最优值分别选择15%、12%和10%(酿酒酵母选择可溶性淀粉添加量为10%，主要是因为单因素结果中，从8%～12%的添加量对细菌存活率具有一定提升，但幅度较小，综合效果和成本因素，虽然没有做10%的实验，但仍选择中间值10%作为最佳值。

图3 可溶性淀粉添加量对益生菌冻干存活率的影响Fig.3 Effect of addition amount of soluble starch on freeze－dried survival rate of probiotics

2.1.4 VC钠盐添加量对三种益生菌冻干存活率的影响 VC钠盐添加量对三种益生菌冻干存活率的影响，结果见图4，随着VC钠盐浓度的增加，植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌三种菌的存活率均逐渐增加，但是当增加到一定浓度后菌体的存活率保持稳定或些许下降，从成本角度考虑，真空冷冻干燥植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌和酿酒酵母菌的冻干保护剂VC钠盐添加量最优值分别选择2%、3%和2%。

2.1.5 单因素显著性分析结果 采用SPSS 4.0对三株菌分别与脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐之间进行单因素显著性分析，结果见表2～表4。

由表2可知，脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐对植物乳杆菌的存活率都有极显著性的差异。因此选择脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐做正交实验。由表3可知，脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐对凝结芽孢杆菌的存活率都有极显著性的差异。因此选择脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐做正交实验。表4可知，脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐对酿酒酵母菌的存活率都有极显著性的差异。因此选择脱脂乳粉、低聚木糖、可溶性淀粉和VC钠盐做正交实验。

表2 植物乳杆菌的单因素显著性分析结果Table 2 The results of single factor significance analysis of L.plantarum SC1

表3 凝结芽孢杆菌的单因素显著性分析结果Table 3 The results of single factor significance analysis of B.Coagulans XP2

表4 酿酒酵母菌的单因素显著性分析结果Table 4 The results of single factor significance analysis of S.cerevisiae SA1

图4 VC钠盐添加量对益生菌冻干存活率的影响Fig.4 Effect of addition amount of VC salt on freeze－dried survival rate of probiotics

2.2 正交试验结果

根据单因素实验确定各保护剂的正交水平数，确定四因素三水平的正交实验表，并用SPSS软件进行极差和方差分析。结果如表5～表10所示。

由表5可知，不同的保护剂添加量对植物乳杆菌冻干存活率有着不同的影响。各保护剂因素对益生菌真空冷冻干燥粉剂的存活率影响大小从大到小顺序排列:C＞D＞A＞B，保护剂添加量最佳组合为:C1D3A2B3，即可溶性淀粉10%，VC钠盐3%，脱脂乳粉12%，低聚木糖14%。由表6可知，四个保护剂的F值均小于0.05，说明对植物乳杆菌冻干存活率均具有显著影响。

由表7可知，不同的保护剂添加量对凝结芽孢杆菌冻干存活率有着不同的影响。各保护剂因素对益生菌真空冷冻干燥粉剂的存活率影响大小从大到小顺序排列:B＞D＞C＞A，保护剂添加量最佳组合为:B2D3C3A2，即低聚木糖8%，VC钠盐4%，可溶性淀粉14%，脱脂乳粉8%。由表8可知，四个保护剂的P值均小于0.05，说明对凝结芽孢杆菌冻干存活率均具有显著影响。

由表9可知，不同的保护剂添加量对酿酒酵母菌冻干存活率有着不同的影响。各保护剂因素对益生菌真空冷冻干燥粉剂的存活率影响大小从大到小顺序排列:B＞D＞A＞C，保护剂添加量最佳组合为:B2D2A2C3，即低聚木糖10%，VC钠盐2%，脱脂乳粉12%，可溶性淀粉12%。由表10可知，四个保护剂的P值均小于0.05，说明对酿酒酵母菌冻干存活率均具有显著影响。

2.3 最优组合效果重复验证

三株菌分别添加最优复配冻干保护剂，进行真空冷冻干燥，检测冻干后活菌数，并计算菌株存活率，具体结果见图5。由图5可知，在最优复配冻干保护剂作用下，冻干存活率分别为植物乳杆菌SC1 83.2%，凝结芽孢杆菌XP2 83.7%，酿酒酵母菌SA1 86.7%，有 效 活 菌 数 分 别 为6.3×108、5.7×108、3.5×108CFU/g，均大于108CFU/g，具有较好的市场价值。

表8 凝结芽孢杆菌L9(34)正交实验方差分析Table 8 The variance analysis of L9(34)orthogonal experiment on B.coagulans XP2

表9 酿酒酵母菌L9(34)正交实验极差分析Table 9 The range analysis of L9(34)orthogonal experiment on S.cerevisiae SA1

3 讨论与结论

不同的保护剂对细胞保护的作用机制有所不同，合理复配不同类型的保护剂，可以有效提高真空干燥冻干发酵剂中活菌存活率［22－24］，本实验对四个候选冻干保护剂进行单因素和正交实验确定最优组合，Carvalho等［25］研究表明脱脂乳粉能稳定细胞膜，提供细胞保护衣以免细胞损伤，可以单独使用或与其他保护剂混合使用均具良好效果。陈合等［26］研究表明在添加了7%的低聚木糖的复配冻干保护剂后，两双歧杆菌的冻干存活率提高到了88.7%;王媚等［27］将10%的可溶性淀粉与其它成分复配，微生态制剂冻干后活菌数高达2.33×1010CFU/pb，田芬等［28］通过添加适量VC钠盐与其它成分复配，可使双歧杆菌和乳酸菌均达到85%以上的冻干存活率。从实验结果来看，不同的菌株对冻干保护剂的复配配方需求也不尽相同，比例也各有差别，说明菌株本身的特性也是影响保护剂选择的主要因素。牛春华等［21］研究发现，植物乳杆菌在可溶性淀粉14%，低聚木糖12%，谷氨酸钠3%，菊糖15%的复配保护剂下，冻干存活率为65.2%，低于本文的83.2%。戚薇等［29］研究发现，凝结芽孢杆菌在脱脂乳15%，谷氨酸钠1%的复配保护剂下，冻干存活率为77%，低于本文的83.7%。张冬生等［30］研究发现，酿酒酵母在蔗糖144.4 g/L，脱脂奶粉100.8 g/L，聚乙二醇11.1 g/L的复合保护剂下，冻干存活率为80.81%，低于本文的86.7%。综上，本研究得到的复配剂配方具有一定的借鉴意义。另外，目前应用较为广泛的另一种益生菌粉制作方法－喷雾干燥法，文献显示，Her等［31］使用喷雾冷冻干燥法制备获得了存活率高达97.7%的一种益生菌粉，但费用较昂贵。Semyonov等［32］发现利用超声波真空喷雾干燥技术能够有效制得包埋有干酪乳杆菌的微胶囊，存活率最高达到70.6%。真空冷冻干燥法与喷雾干燥法相比，具有一定优势，成本适中，冻干存活率高等。

表10 酿酒酵母菌L9(34)正交实验方差分析Table 10 The variance analysis of L9(34)orthogonal experiment on S.cerevisiae SA1

图5 最优冻干保护剂组合下的三株菌冻干存活率和有效活菌数Fig.5 The lyophilized survival rate and effective viable count of three strains under the optimum combination of Lyophilized protectants

本研究得出植物乳杆菌保护剂最佳配方组合为:可溶性淀粉10%，VC钠盐3%，脱脂乳粉12%，低聚木糖14%;凝结芽孢杆菌保护剂配方最佳组合为:低聚木糖8%，VC钠盐4%，可溶性淀粉14%，脱脂乳粉8%;酿酒酵母菌保护剂配方最佳组合为:低聚木糖10%，VC钠盐2%，脱脂乳粉12%，可溶性淀粉12%。在最优配方保护剂下，三株菌的冻干存活率分别 为83.2%、83.7%和86.7%，活 菌 数 均 高 于1.0×108CFU/g，具有较好的应用价值。