硝酸盐促进环磷酸腺苷发酵合成的生理机制研究

李志刚，顾 阳，陈宝峰，王宝石，张中华，常景玲，*

(1.现代生物育种河南省协同创新中心，河南新乡453003;2.河南科技学院生命科技学院，河南新乡453003)

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是生物体内广泛存在的一种生理活性物质，对细胞的各种代谢活动以及核酸和蛋白质等物质的合成具有重要的调节作用［1］。该物质在体内可以促进心肌细胞存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和抗缺氧能力，临床上主要用于心功能不全、心绞痛和心肌梗死等疾病的治疗，另外，其作为饲料添加剂广泛应用于畜禽产品的生产中，具有十分重要的应用价值［2－3］。

微生物合成cAMP代谢过程涉及糖酵解途径、磷酸戊糖途径、嘌呤核苷酸合成途径、腺苷酸合成途径和三羧酸循环，代谢流分配情况是影响cAMP合成的重要因素［4］。Chen等［5］利用不同的抑制剂调节糖酵解途径代谢强度，结果表明氟化钠显著提高了cAMP的产量和得率。Niu等［6］利用13C示踪实验对添加氟化钠条件下的碳流分配情况进行研究，结果表明糖酵解途径代谢强度明显下降，同时磷酸戊糖途径的代谢强度显著上升。此外，Niu等［7］利用比较转录组和蛋白质组学分析方法对高溶氧条件下cAMP产量显著提高的原因进行研究，发现糖酵解途径中酶的转录水平明显下降，而三羧酸循环和嘌呤核苷酸合成途径中酶的转录水平和表达量明显上升。因此，合理调节碳流在糖酵解和磷酸戊糖途径间的分配，能够有效促进cAMP的积累。

6－磷酸葡萄糖脱氢酶是改变碳流分配的关键酶，活性受NADPH的反馈抑制，消除过量的NADPH有利于碳流更多的分配到磷酸戊糖途径［8］。硝酸盐是一种氧化性强的氮源，在硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶顺序催化作用下转化为铵态氮，同时该还原反应需要NADPH作为辅酶才能进行［9－10］。微生物利用硝酸盐的过程会消耗大量NADPH，还原性辅酶NADPH水平下降会提高6－磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，还会影响其他代谢途径中酶的活性，进而改变代谢流分配情况［11－13］。

本文针对cAMP从头合成途径的代谢特点，通过适量添加硝酸钠的方式促进产物合成，并从cAMP发酵动力学、还原性辅酶水平、关键酶活性、胞内氨基酸水平以及能量代谢水平等方面进行研究，阐明硝酸盐促进cAMP发酵合成的生理机制，为硝酸盐在核苷酸类产品发酵生产中应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

节杆菌(Arthrobacter sp.)A.sp01 本实验室筛选并保藏于中国典型培养物保存中心(保藏号为CCTCC No.M2013431);cAMP、ATP、AMP、NADH、NAD+分析纯，阿拉丁生化科技股份有限公司;苯酚、次氯酸钠、水杨酸、对氨基苯磺酸、α－萘胺 分析纯，国药集团化学试剂有限公司;6－磷酸葡萄糖脱氢酶试剂盒、NADPH与NADP+浓度测定试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;AccQ－Tag氨基酸分析试剂包、氨基酸柱 沃特世科技(上海)有限公司(Waters);其他试剂 均为市售国产或进口分析级纯。

LDZX－50KBS高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;SW－CJ－2FD双人垂直净化工作台 苏净集团安泰公司制造;ZWF－2112摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;UV－2800紫外分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;BIOTECH－7BG机械搅拌式发酵罐 上海保兴生物设备有限公司;Aglient 1260 Infinity液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;VC150超声波破碎仪 美国Sonics＆Materials公司;pH和DO电极 瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制 斜面培养基、种子培养基和发酵培养基的组成及配制参见文献［14］。

1.2.2 培养方法

1.2.2.1 发酵罐培养 7 L机械搅拌式发酵罐配备pH和DO电极各一支，装载发酵培养基5 L(初始葡萄糖浓度为80 g/L)。121℃、高压蒸汽灭菌20 min，接种量10%，发酵温度30℃，初始pH调节至7.4待下降至6.8时保持不变，搅拌转速初始400 r/min视溶氧变化情况逐渐增加至500 r/min，通风量从起始的0.1 vvm提升至0.6 vvm。

1.2.2.2 硝酸盐添加方法 发酵罐发酵实验:发酵过程进行至24 h一次性添加3 g/L－broth的硝酸钠。摇瓶发酵实验:设置1、2、3、4和5 g/L－broth等5个不同添加量和0、16、24和36 h等4个不同添加时间，共计20个不同组合，每个组合作3个平行试验。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 菌体浓度(OD600)和菌体干重(DCW)测定 菌体浓度采用光密度法测定，发酵液稀释适当倍数，在600 nm波长下测吸光度，所测数值乘以稀释倍数即为OD600;菌体干重通过关系式DCW(g/L)=0.46×OD600计算得出［15］。

全省湿地总面积2606万亩，有效维护生态平衡、保护生物多样性。图为“国际重要湿地”黄河三角洲国家级自然保护区。

1.2.3.2 葡萄糖浓度测定 采用DNS法进行测定［15］。

1.2.3.3 cAMP与次黄嘌呤测定 使用高效液相色谱进行测定［5］，取适量发酵液于离心管中，9000 r/min，离心10 min。上清液经过0.45μm孔径的水相膜过滤后待测。色谱条件:色谱柱为Lichrospher C18柱(4.6 mm×300 mm，5μm)，进样量5μL，有机相为甲醇，水相为磷酸三乙胺缓冲液(0.6%的磷酸溶液，用三乙胺调p H为6.6)，水相与有机相体积比为70∶30，流速0.8 mL/min，柱温30℃，波长254 nm。

1.2.3.4 pH和CO2含量测定 p H由发酵罐配备的电极在线测定，尾气中CO2含量由尾气分析仪在线测定。

表1 硝酸钠不同添加时间和添加量对cAMP发酵产物浓度的影响(g/L)Table 1 The effects of sodium nitrate on cAMP fermentation production with different addition time and amounts(g/L)

1.2.3.6 细胞内ATP、AMP、NADH和NAD+浓度测定取5 mL发酵液，在4℃、9000 r/min条件下离心10 min。所得菌体于液氮中处理2 min，使细胞代谢瞬间停止。用PBS缓冲液洗涤细胞两次，重新悬浮在5 mL的PBS缓冲液中，冰浴条件下超声波破碎10 min，超声3 s，停5 s。在4℃，12000 r/min条件下离心15 min，上清液用0.22μm孔径的滤膜过滤后待测。ATP、AMP采用高效液相色谱法进行测定，具体方法参见文献［15］;NADPH与NADP+浓度采用试剂盒进行测定，操作方法和步骤按照说明书进行。

1.2.3.7 关键酶活性测定 6－磷酸葡萄糖脱氢酶活性采用试剂盒进行测定，操作方法和步骤按照说明书进行;异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和琥珀腺苷酸合成酶活性测定方法参见文献［18］，比酶活以U/mg蛋白表示。

1.2.3.8 蛋白浓度测定 采用考马斯亮蓝染色法测定［18］。

1.2.3.9 胞内氨基酸浓度测定 在不同发酵时期，分别取50 mL发酵液，12000×g离心10 min，使用超纯水洗涤2次。细胞重悬于1 mL 10%(w/v)的三氯乙酸中，37℃放置10 min，煮沸15 min。12000×g离心10 min除去细胞碎片，上清经0.22μm滤膜过滤后［19－20］，采用Waters公司开发的AccQ－Tag法进行测定，操作方法和步骤按照说明书进行。

1.3 数据处理

2 结果与讨论

2.1 硝酸钠最佳添加时间与添加量的确定

在250 mL锥形瓶中进行了添加硝酸钠的cAMP发酵实验，以产物浓度为指标确定最佳添加时间和添加量。如表1所示，硝酸钠添加量和添加时间对cAMP产量均有较为明显的影响，24 h添加3 g/Lbroth硝酸钠时cAMP浓度达到最高的3.58 g/L，比对照提高了36.6%，与其他组合条件相比具有显著差异。因此，将24 h添加3 g/L－broth硝酸钠确定为最佳操作条件，在7 L发酵罐上进行发酵实验。

2.2 硝酸盐对7 L发酵罐中cAMP发酵性能的影响

在7 L机械搅拌式发酵罐上进行了添加硝酸钠的发酵实验，添加时间为24 h，添加量为3 g/Lbroth，其它操作条件与对照批次一致。如图1所示，添加硝酸钠发酵批次的cAMP终产量达到5.02 g/L，比对照批次提高了22.7%，而葡萄糖消耗量有一定幅度的下降，cAMP对葡萄糖的得率达到了0.097 g/g，比对照提高了29.8%。在发酵中后期(36～60 h)，对照批次的产物合成速率明显变慢，产物增加量很少，而添加硝酸盐批次的产物合成仍较为活跃，合成量比对照批次高出约1.0 g/L，有效促进了产物的合成与积累。这可能是由以下3个原因导致的:a.硝酸钠作为一种氧化性氮源，利用过程消耗大量还原力(NADPH或NADH)，一定程度上影响了菌体的生长和葡萄糖的利用;b.还原力的消耗缓解了NADPH对6－磷酸葡萄糖脱氢酶的反馈抑制，使碳流更多的分配到产物合成途径;c.还原力的消耗致使副产物(乙酸和乳酸)合成大幅下降，从而提高了产物的转化率。由图1C可知，两批次中pH均呈现先降后升的趋势，在36 h后添加硝酸盐批次的pH回升速度明显快于对照批次，有机酸合成量减少和碱性物质生成导致p H的迅速回升。添加硝酸盐批次尾气中CO2比例明显高于对照批次(图1D)，表明菌体的代谢活性得到增强。

另外，两批次中次黄嘌呤浓度在40 h后均降到0.2 g/L以下，且基本没有变化，cAMP是通过从头合成途径进行合成的。cAMP的从头合成途径涉及到糖酵解与磷酸戊糖途径间的碳流分配、能量供应以及氨基酸供应等问题，因此，可以从硝酸盐利用、代谢途径关键酶活性水平、辅因子和ATP变化规律、氨基酸代谢等方面阐明硝酸盐促进cAMP合成的生理机制。

2.3 硝酸盐对氮代谢和细胞内还原性辅酶水平的影响

图1 添加硝酸钠对cAMP发酵性能的影响Fig.1 The effect of sodium nitrate on cAMP fermentation performance

硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶必须要有还原型辅酶(NADH或NADPH)提供还原力才能完成催化反应，因此，对反映细胞内氧化还原状态的NADH/NAD+和NADPH/NADP+进行测定。如图3所示，添加硝酸盐批次细胞内NADH/NAD+明显高于对照批次的，而NADPH/NADP+却明显低于对照批次的，表明上述两种还原酶主要以NADPH作为辅酶来还提供原力，而NADH/NAD+的提高表明细胞能量代谢得到强化。这也解释了添加硝酸盐批次呼吸代谢旺盛而菌体浓度较低的现象，NADPH/NADP+的大幅降低，使细胞组分的合成受到影响，进而影响菌体生长。

2.4 硝酸盐对cAMP合成途径中关键酶活性的影响

微生物合成cAMP过程涉及到糖酵解、磷酸戊糖途径、嘌呤核苷酸合成途径以及三羧酸循环等。代谢流在不同途径间的分配对产物合成具有显著影响，而代谢网络中关键节点处酶活性变化反映了代谢途径的强弱和碳流分配情况。

图2 添加硝酸钠时cAMP发酵液中铵态氮和硝态氮的变化情况Fig.2 Time courses ofand concentrations in fermentation with sodium nitrate added

如图4所示，添加硝酸盐批次的丙酮酸脱氢酶活性比对照批次有一定程度下降，糖酵解途径的代谢强度弱化;而异柠檬酸脱氢酶、6－磷酸葡萄糖脱氢酶和琥珀腺苷酸合成酶的活性均一定程度上高于对照批次，表明代谢流更多的分配到磷酸戊糖途径为产物合成提供碳骨架，同时三羧酸循环的代谢强度也得到强化。同时细胞内高NADPH/NADP+水平会抑制6－磷酸葡萄糖脱氢酶的活性，本文中硝酸钠利用过程以NADPH为辅酶，使胞内NADPH/NADP+水平显著下降，解除或缓解了对6－磷酸葡萄糖脱氢酶的抑制作用，提高了该酶的活性，进而将更多的碳流分配到磷酸戊糖途径为产物合成提供碳骨架，促进了产物的合成。

图3 硝酸钠对胞内氧化还原水平的影响Fig.3 The effects of sodium nitrate on NADPH/NADP+and NADH/NAD+

图4 硝酸盐对cAMP发酵代谢过程中关键酶活性的影响Fig.4 The effects of sodium nitrate on the activities of sAMPase，PGH，ICDH and G6PD

2.5 硝酸盐对c AMP发酵过程中氨基酸合成的影响

对添加硝酸钠发酵批次的细胞内氨基酸含量进行测定，结果表明，添加硝酸盐批次中有12种氨基酸的含量高于对照批次，其中6种氨基酸含量得到明显提高，分别是天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和异亮氨酸(图5)。天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸是微生物通过从头合成途径进行cAMP合成的前体氨基酸，能够部分或整体的整合到嘌呤环上，是产物合成的材料来源;同时天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和精氨酸均是以三羧酸循环的代谢物为碳骨架进行合成的。硝酸盐的利用不仅为氨基酸合成提供了氮素，还通过强化三羧酸循环提供了碳骨架，促进了氨基酸代谢，进而促进产物合成。

图5 硝酸盐对细胞内氨基酸合成的影响Fig.5 The effects of sodium nitrate on the amounts of intracellular amino acids

2.6 硝酸盐对cAMP合成过程中能量代谢的影响

cAMP是由ATP在腺苷酸环化酶的催化下合成的，高ATP水平有利于产物的合成;而ATP/AMP则一定程度上体现了细胞内磷酸化水平和ATP合成水平。如图6所示，添加硝酸盐发酵批次的细胞内ATP含量和ATP/AMP均明显高于对照批次，结合NADH/NAD+的提高，表明硝酸盐能够强化能量代谢，有利于胞内ATP的合成。

图6 硝酸盐对胞内ATP含量和ATP/AMP比的影响Fig.6 The effects of sodium nitrate on intracellular ATP concentration and ATP/AMP

3 结论

发酵24 h添加3 g/L－broth硝酸钠时，cAMP发酵性能得到明显提升。硝酸盐利用过程消耗了大量NADPH，缓解了对6－磷酸葡萄糖脱氢酶的抑制作用，同时糖酵解途径受到抑制而磷酸戊糖途径和三羧酸循环中关键酶活性明显提高，更多碳流分配到产物合成途径。此外，胞内前体氨基酸水平、NADH/NAD+和ATP/AMP均得到明显提高，为cAMP的发酵合成与积累提供了物质和能量基础。硝酸盐利用过程消耗了大量的还原力，改变了代谢流分配情况，提高了胞内氨基酸水平和ATP合成，为cAMP发酵合成提供了物质和能量基础。硝酸盐作用机制的阐明，为提高核苷酸类发酵产品的生产水平提供了参考。