一株野生梭伦剥管孔菌的鉴定及其生物学特性*

张云龙，王慧真，王 震，刘保卫，郑素月**

（1.河北工程大学园林与生态工程学院，河北 邯郸 056021；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056021；3.黄淮学院生物与食品工程学院，河南 驻马店 463000）

梭伦剥管孔菌（Piptoporus soloniensis） 为世界性分布，属于非褶菌目（Polyporales） 多孔菌科（Polyporaceae） 剥管孔菌属 （Piptoporus）。剥管孔菌属由Karsten在1881年建立，包括3个种，分别为桦剥管孔菌 [Piptoporus betulinus(Bull.)P.Karst]、栎剥管孔菌 [Piptoporus quercinus(Schrad.)Pilát] 和梭伦剥管孔菌 [P.soloniensis(Dubois)Pilát][1－3]，其模式种为桦剥管孔菌（P.betulinus）[4]。梭伦剥管孔菌与硫磺菌（Laetiporus sulphureus） 子实体在某些特征上有些相似，故从形态上经常被误认为硫磺菌，1983年Lombard将梭伦剥管孔菌与硫磺菌从菌丝和孢子特征方面进行了区分[5]。研究发现，梭伦剥管孔菌在液体培养中产生热带水果的香味，通过气相色谱－质谱分析法分别鉴定出其主要和次要化合物为γ－癸内酯和γ－辛醇内酯，而γ－癸内酯可以作为食品香料、日用化妆品香精以及饲料香味剂等[6]。梭伦剥管孔菌中分离制备的肽酶（PsoP1）可作为凝乳酶的替代品，在医学上具有较大的开发价值[7]。

在野生食用菌的资源开发、保护、利用方面，野生食用菌的分离鉴定是一项基础性工作，结合形态学和分子ITS鉴定，对野生食用菌进行分类、开发等基础工作，为完善大型真菌的种属分类提供依据。关于梭伦剥管孔菌的研究，目前未发现国内相关报道。通过对采集野生梭伦剥管孔菌进行形态学和分子学鉴定，培养测定该菌株菌丝体的生长发育条件，以期为该菌株的驯化、食（药）用价值研究、商用价值开发等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

野生子实体采集于河南省南阳市南召县马市坪乡南坪村 （东经 115°55′，北纬 33°12′，海拔 933 m）。采集时间为2018年7月29日，子实体长于山中漆树上，由河北工程大学食用菌实验室进行菌种分离、鉴定和保藏，菌株编号为NZ25。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定

对子实体的形态、大小、颜色、气味、菌柄的长短、菌环的有无等进行观察鉴定；采用组织分离法获得纯培养菌丝体，菌丝体形态采用插片观察法[8]。

1.2.2 ITS鉴定

DNA试剂盒（天根生化科技北京有限公司）提取菌丝体DNA，利用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和 ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATTGATATGC-3’） 进行扩增。PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行克隆测序。将得到的菌株ITS序列在NCBI数据库中BLAST比对，利用Clustal_X软件对所得序列进行校正和比对分析，选取相近属不同种的ITS序列，采用MEGA 6.0软件，以Neighbor-joining法构建系统进化树。

1.2.3 最适温度

打孔器取菌龄一致菌饼，接种于PDA综合培养基平板中央，接种后平板分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃恒温箱中培养，用十字划线法测量菌落直径，每个处理3次重复。

1.2.4 最适pH

分别设置pH梯度为5、6、7、8、9，共5个处理，每个处理3次重复。

1.2.5 最适碳源

以PDA培养基为基础，分别用不同的碳源代替葡萄糖，供试碳源有麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉，以不添加葡萄糖的基础培养基做空白对照，每个处理3次重复。

1.2.6 最适氮源

供试氮源有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸钾、硝酸铵、酒石酸铵，添加量均为2 g·L-1，以不添加氮源的基础培养基做空白对照，每个处理3次重复。

1.2.7 最适无机盐

供试无机盐有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、氯化钙、氯化钠、硫酸镁，添加量均为2 g·L-1，以不添加无机盐的基础培养基做空白对照，每个处理3次重复。

1.2.8 最适生长因子

供试生长因子有VB1、VC、VE，添加量均为2片/L，空白对照中不添加生长因子，每个处理3次重复。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果与分析

菌株NZ25的子实体和菌丝体形态（显微镜倍数为10×40倍），见图1。

图1 NZ25菌株形态特征Fig.1 Morphological characteristics of strain NZ25

如图1所示，菌株NZ25的子实体菌盖不规则、半圆形，表面白色至浅橙色或浅褐色；子实体层不规则，无环带，菌肉白色至黄色；菌落圆整，菌丝淡黄色，气生菌丝不发达，有浓郁的皂香味；显微观察可见生殖菌丝具有明显的锁状联合。

2.2 ITS鉴定和分析

经ITS-PCR扩增测序，获得NZ25菌株的ITS序列，电泳图见图2。

如图2所示，扩增片段大小为650 bp。将所得序列在NCBI的Genbank数据库中进行Blast比对，同时选取了拟层孔菌属（Fomitopsis）、硫磺菌属（Laetiporus） 等其他10株不同种真菌序列构建系统发育树，结果见图3。

图2 供试菌株ITS扩增电泳图Fig.2 Electrophoresis map of ITS sequence of test strain

图3 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequence

如图3所示，该菌株与梭伦剥管孔菌（MF445223.1） 相似性最高，为100%。因此确定该菌株为梭伦剥管孔菌。

2.3 最适温度

不同培养温度下NZ25菌株的菌丝长势和生长速度见图4、表1。

图4 不同温度对梭伦剥管孔菌菌丝生长的影响Fig.4 Effects of different temperature on mycelial growth of Piptoporus soloniensis

表1 不同温度对菌株NZ25菌丝生长的影响Tab.1 Effects of different temperature on mycelial growth of strain NZ25

由图4、表1可知，该菌株在15℃～35℃的温度范围内均可以生长。菌丝平铺型生长，边缘整齐，菌落圆整，分泌淡黄色色素，初期白色，颜色逐渐从中间向边缘扩散，有特殊的皂香味；30℃菌丝生长速度最快，10℃条件下菌丝不生长。

2.4 最适pH

不同pH对菌株NZ25菌丝生长的影响见表2。

表2 不同pH对NZ25菌株菌丝生长的影响Tab.2 Effects of different pH on mycelial growth of strain NZ25

由表2可知，在不同pH条件下，菌丝均是平铺型生长，有皂香味，颜色浅黄色。在pH为8时，生长速度最快，颜色浅，但长势弱；pH为5、6时，生长速度较慢，颜色深，长势一般；pH为7时，生长速度中等，颜色较深，长势强。结合菌丝生长速度和长势，该菌株最适pH为7。

2.5 最适碳源

不同碳源对菌丝生长影响见表3和图5。

表3 不同碳源对菌株NZ25菌丝生长的影响Tab.3 Effects of different carbon sources on mycelial growth of strain NZ25

由表3、图5可知，菌丝均是平铺型生长，均有香味，颜色由接种块至边缘扩散，气生菌丝不明显，从菌丝生长速度来看，以甘露醇、葡糖糖为碳源时，菌丝生长速度最快，并且颜色均匀呈黄色、边缘整齐；其次是麦芽糖，表现出菌落颜色浅、边缘整齐。

图5 不同碳源对菌株NZ25菌丝生长的影响Fig.5 Effects of different carbon sources on mycelial growth of strain NZ25

2.6 最适氮源

不同氮源对菌丝生长的影响见表4。

表4 不同氮源对菌株NZ25菌丝生长的影响Tab.4 Effects of different nitrogen source on mycelial growth of strain NZ25

由表4可知，不同氮源对菌丝生长速度影响差异不明显，菌丝平铺型生长，有香味，颜色是由接种块至边缘扩散，综合比较，优选牛肉膏做氮源。

2.7 最适无机盐

试验菌株在不同无机盐下的生长情况见表5。

由表5可知，菌丝均是平铺型生长，均有香味，颜色浅黄色，菌落边缘均较为整齐。从生长速度看，在硫酸镁和氯化钠培养基中，菌丝生长速度明显高于其他处理（P＜0.05）。综合生长速度和长势，该菌株最适宜的无机盐为硫酸镁。

表5 不同无机盐对菌株NZ25菌丝生长的影响Tab.5 Effects of different inorganic salt on mycelial growth of strain NZ25

2.8 最适生长因子

不同生长因子对菌丝生长影响见表6。

由表6可知，在4种培养基中，菌丝均以平铺型生长，有香味，颜色浅黄色。在以VB1为添加条件时，菌落边缘整齐，菌丝生长速度、生长势和颜色优于VC组和VE组。

表6 不同生长因子对菌株NZ25菌丝生长的影响Tab.6 Effects of different growth factor on mycelial growth of strain NZ25

3 结论

利用形态学特征进行食用菌的初步鉴定和分类是传统且初级的方法，但由于外界环境的不稳定性，多种原因都可能会造成食用菌菌株的变异，从而造成食用菌较高的形态多样性。因此传统的分类方法无论是在子实体的形态特征、生长特性、理化指标的描述，均会对菌物的鉴定存在误差和分歧，即若只是从简单的形态特征来对大型真菌鉴定具有局限性，尤其是在辨别形态上极为相近的种时，很难做出准确的判断、区分。而与现代分子生物技术相结合，即在DNA基础上的ITS测序，就可以更好解决鉴定和分类的难题。利用ITS序列分析技术，通过PCR扩增，序列测定可以实现样品的分子鉴定，适用于不同分类水平的物种鉴定和系统发育研究。

梭伦剥管孔菌由于与硫磺菌形态相似，在当地多年来一直被误认为是硫磺菌，幼嫩时可食用，味道鲜美。通过传统的形态学研究和分子生物学技术相结合，证实了该菌株属于剥管孔菌属的梭伦剥管孔菌（P.soloniensis）。通过菌丝体生长适宜条件研究，结果表明梭伦剥管孔菌对不同因子的选择有差异，在碳源方面，甘露醇和葡萄糖是最适碳源，在生长速度和长势方面均优于其他碳源；梭伦剥管孔菌对有机氮有相对较好的利用，硝态氮利用一般，对铵态氮利用较差，一般来说在菌丝营养生长阶段有机氮更有利于菌丝体生长；温度试验表明梭伦剥管孔菌菌丝在15℃～35℃均能生长，在30℃左右时生长最好；在pH试验中，pH为7时生长较好。在对梭伦剥管孔菌的菌丝体培养中，发现该菌丝体具有浓郁的皂香味，但关于梭伦剥管孔菌的研究报道在国内没有发现，这种香味的来源及该菌株的开发利用还有待于进一步研究。