丁香微乳的质量控制试验

何晓蓓，冉 洋，贺涛涛，范云鹏，麻武仁，刘迎秋，宋晓平

(西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100)

丁香为桃金娘科植物丁香(EugeniacaryophyllataThunb.)的干燥花蕾，温中降逆，补肾壮阳，主治胃寒呕吐、肚胀、冷肠泄泻、肾虚阳痿[1]。现代药理研究表明，丁香具有抗氧化、杀菌、杀螨、解热镇痛等作用[2-3]。化学成分研究发现，丁香主要含丁香酚、石竹烯、α-葎草烯等成分[4]。阮娜等[5]从200味中药提取物中发现丁香杀螨活性最为突出，其活性成分为丁香酚。郭超[6]将丁香提取物制成丁香微乳制剂。本试验采用薄层色谱法(TLC)对丁香微乳进行定性鉴别，采用高效液相色谱法(HPLC)测定丁香酚含量，旨为该制剂的质量控制及进一步应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 丁香提取物(丁香酚含量为58.70 mg/g)，实验室自制(批号：20170114)；丁香酚对照品(纯度99.3%，批号：110725-201615)，丁香对照药材(批号：121039-201405)，均购自中国食品药品检定所。

1.1.2 主要试剂 聚氧乙烯氢化蓖麻油40(RH40)，药用辅料，批号：73870868E0，德国巴斯夫；油酸乙酯(EO)，药用辅料，批号:YO20170905，山东瑞生药用辅料有限西安公司；丙二醇，药用辅料，批号：20171002，江西益普生药业有限公司；甲醇，色谱纯，批号：20171223，天津市科密欧化学试剂有限公司；硅胶G薄层板(100 mm×100 mm)，批号：20170831，青岛海洋化工有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 SP-20E型全自动薄层色谱点样仪，上海科哲生化科技有限公司；2F-8型暗箱四用紫外分析仪，上海勤科分析仪器有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 丁香微乳的制备 称取RH40 54 g、丙二醇18 g、EO8 g搅拌均匀作为丁香微乳的油相。向油相中加入丁香提取物2 g，搅拌均匀后3 000 r/min离心15 min，取上清液。称取加提取物微乳油相 40 g， 逐滴加蒸馏水60 g，边滴加边搅拌即得[6]。

1.2.2 丁香微乳的鉴别 (1)对照品溶液的制备：参照《中国兽药典》2015版二部中的方法，取丁香酚对照品，加乙醚制成每1 mL中含16 μL的溶液，作为丁香酚对照品溶液[1]。(2)对照药材溶液的制备：参照《中国兽药典》2015版二部中的方法，取丁香对照药材粉末0.50 g置锥形瓶内，加5 mL乙醚，振摇1 min，过滤，滤液作为丁香对照药材溶液[1]。(3)供试品溶液的制备：称取丁香微乳20.02 g，加无水硫酸钠2.01 g，超声破乳30 min，加石油醚(30～60 ℃)20 mL萃取3次，合并石油醚萃取液层，室温挥干，加乙醚2 mL溶解即得[7]。(4)阴性对照溶液的制备：参照1.2.1项制备不含丁香提取物的空白微乳，参照1.2.2(3)项称取空白微乳20.00 g，制成阴性对照溶液。(5)薄层色谱鉴别：丁香酚对照品、对照药材溶液各5 μL，供试品、阴性对照溶液各10 μL， 分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)- 乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至105 ℃，置紫外灯(365 nm)下检视。

1.2.3 丁香微乳的含量测定 (1)色谱条件:色谱柱为Welchrom C18(4.6 nm×250 nm，5 μm)，流速为 1 mL/min， 柱温为40 ℃[8]，进样量为20 μL，流动相为甲醇-水(55∶45)[9]，检测波长为282 nm。(2)对照品溶液的制备:精密称定丁香酚对照品0.027 5 g，置于25 mL的容量瓶中，定容至刻度，制成含丁香酚1.100 0 mg/mL的丁香酚对照品溶液。(3)供试品溶液的制备：取丁香微乳约3 g，精密称定，加入50 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，过滤即得[10]。(4)阴性对照溶液的制备：参照1.2.1项制备不含丁香提取物的空白微乳，参照1.2.3(3)项制备阴性对照品溶液。(5)专属性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液20 μL， 注入液相色谱仪，记录色谱图。(6)线性关系的考察：精密量取1.2.3(2)项制备的对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL和0.6 mL置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分别精密吸取20 μL注入液相色谱仪，并记录峰面积。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。(7)精密度试验：精密吸取浓度为0.033 0 mg/mL的对照品溶液20 μL， 分别进样6次，记录其峰面积并计算其RSD。(8)稳定性试验：精密称定丁香微乳3.006 3 g制成供试品溶液，在0、2、4、6、8、12 h和24 h进行检测，计算其RSD。(9)重复性试验：取同一批丁香微乳，参照1.2.3(3)项平行制备6份供试品溶液进行检测，计算其含量的RSD。(10)加样回收率试验：分别取9份丁香微乳约1.5 g，精密称定，分成3组，分别向每组中加入高、中、低3个浓度的丁香酚对照品溶液。分别进行含量测定，计算回收率及其RSD。(11)含量测定：分别取3批丁香微乳约3 g，精密称定，制成供试品溶液，每批检测3次，计算丁香微乳中丁香酚含量。

2 结果

2.1 丁香微乳的鉴别 在紫外灯(365 nm)下，丁香微乳色谱中，在与对照药材或丁香酚对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰(图1)。

图1 丁香微乳薄层色谱图Fig.1 TLC of Caryophylli Flos microemulsion1:空白微乳； 2:丁香微乳； 3:丁香对照药材； 4:丁香酚对照品1:Blank microemulsion; 2:Caryophylli Flos microemulsion;3:The control herbs of Caryophylli Flos; 4:Standard eugenol

2.2 丁香微乳的含量测定

2.2.1 专属性试验 丁香微乳色谱峰中丁香酚与杂质峰分离良好，分离度大于1.5，理论塔板数不小于3 000，空白微乳对丁香微乳中丁香酚的测定无干扰(图2和图3)。

图2 丁香微乳高效液相色谱图Fig.2 HPLC of Caryophylli Flos microemulsion

图3 空白微乳高效液相色谱图Fig.3 HPLC of blank microemulsion

2.2.2 线性关系的考察 丁香酚在浓度0.011 0～0.066 0 mg/mL内呈良好线性关系(r=1.000 0)，线性拟合回归方程为y=22 545 602.597 4x+30 256.800 0(图4)。

图4 丁香酚标准曲线Fig.4 The calibration curve of eugenol

2.2.3 精密度试验 浓度为0.033 0 mg/mL的丁香酚对照品溶液，6次的峰面积分别为770 800、771 293、771 073、774 662、778 299和779 222，RSD为0.49%。说明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 丁香微乳溶液在0、2、4、6、8、12 h和24 h的峰面积分别为707 159、706 377、706 552、709 760、706 634、706 508和705 193，RSD为0.20%。说明丁香微乳溶液在24 h内稳定。

2.2.5 重复性试验 在丁香微乳重复性试验中，峰面积的RSD=0.56%(表1)，说明重复性良好。

表1 丁香微乳重复性试验结果Table 1 The repeatability test results of Caryophylli Fols microemulsion

2.2.6 加样回收率试验 丁香微乳剂加样回收率试验中所测丁香酚的平均回收率是100.60%，其RSD=1.00%(表2)，说明准确性高。

表2 丁香微乳加样回收率试验结果Table 2 The recovery test results of Caryophylli Fols microemulsion

2.2.7 含量测定 丁香微乳中丁香酚含量3次测定结果分别为0.05%、0.049%、0.05%(表3)，平均含量为0.049 7%。

表3 丁香微乳中丁香酚含量检测结果Table 3 The determination results of eugenol content in Caryophylli Flos microemulsion

3 讨论

3.1 关于丁香微乳的薄层色谱鉴别 采用薄层色谱法鉴别中药制剂时，样品的制备和展开剂的选择对待测斑点的集中性与其他斑点的分离度起重要作用[11]。本试验在丁香微乳的薄层色谱鉴别中，参照戴建锋[7]样品前处理方法，将无水硫酸钠加入丁香微乳中，超声破乳，石油醚进行萃取，挥干石油醚，再加乙醚进行溶解。根据薄层色谱的分析技术原理[12]，本试验所用展开剂，通过调节石油醚与乙酸乙酯的比例来改变展开剂的极性，在2015版兽药典的展开剂的基础上，增大展开剂的极性，最终确定使用石油醚(60～90 ℃)∶乙酸乙酯=5∶1作为丁香微乳薄层色谱鉴别的展开剂，丁香酚与相邻物质的分离度更高，且斑点位于薄板中间位置，与丁香酚对照品相同位置处斑点清晰可见，且空白微乳无干扰。

3.2 关于丁香微乳的含量测定 中国兽药典2015版二部采用气相色谱法对丁香药材中丁香酚含量进行测定[1]，而高效液相色谱法(HPLC)在中药成分含量测定中逐渐得以广泛应用。黎迎等[11]以甲醇-1%醋酸水(55∶45)为流动相，采用HPLC对丁香药材中丁香酚进行了含量测定，结果表明HPLC法测定丁香中丁香酚的含量高于药典气相色谱法。陈岳蓉等[13]也采用HPLC测定了藏药七味诃子散中有效成分丁香酚的含量。本试验采用Welchrom C18色谱柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)，以甲醇-水(55∶45)为流动相对丁香微乳中丁香酚含量进行测定，结果表明，丁香酚在0.011 0～0.066 0 mg/mL范围内有良好线性关系(r=1.000 0)，平均回收率100.60%，RSD=0.99%。说明所建立方法专属性强，重现性好，稳定准确。