高效液相色谱法检测德拉昔布咀嚼片含量方法的建立

于泓潇，李思鸿，肖天石，张艺馨，杨雨齐，李佳瑞，杨洪亮，张秀英

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

德拉昔布属于非甾体类解热镇痛抗炎药物，化学名为4-[5-(3-氟-4-甲氧基苯基)-3-二氟甲基-1H-咪唑-1-基]苯磺酰胺，分子式为C17H14F3N3O3S，分子量为397.38，是环氧酶-2选择性抑制剂中的一员，也是第1款被美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于犬的环氧酶-2选择性抑制剂[1]，临床上用于治疗犬的骨关节炎症及疼痛，并可预防犬牙科与骨科手术后的疼痛[2]。德拉昔布对环氧酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)具有高度的选择性抑制作用，从而阻断下游致炎、致痛性前列腺素合成[3]，产生抗炎和镇痛作用，而对环氧酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1)抑制作用较小，因此对COX-1的正常生理性功能影响较小[4]。相比于其他非选择性环氧酶抑制剂，即传统非甾体抗炎药物(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)，德拉昔布对消化系统的损害(如溃疡、出血、黏膜损伤)明显减轻[5-6]。因其抗炎、镇痛效果好，胃肠道副作用小等优势，在治疗犬骨关节炎、风湿性关节炎引起的疼痛等方面，德拉昔布已逐渐替代其他非选择性环氧酶抑制剂，成为美国兽医临床治疗的主流选择[7]。

目前，德拉昔布咀嚼片(Deracoxib chewable tablets)尚未在中国大陆上市，对其含量测定方法也未见报道。本试验建立了高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)检测德拉昔布咀嚼片含量的方法，并对实验室自制的德拉昔布咀嚼片与美国已经上市的Deramaxx咀嚼片进行含量检测，为德拉昔布咀嚼片质量标准的建立以及产品的质量控制提供依据[8-9]。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 德拉昔布咀嚼片(实验室自制，规格25 mg，批号：20180507、20180514、20180521)；德拉昔布标准品(北京Absin公司，CAS号：169590-41-4，纯度 99%)；Deramaxx(美国Novartis公司，规格：25 mg，批号：175227C)；乙腈(色谱纯，美国Sigma公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王和天下材料有限公司)；磷酸二氢钾(分析纯，西陇科学有限公司)。

1.2 主要仪器 Waters e2695高效液相色谱系统(美国Waters公司)；Waters 2998 紫外检测器(美国 Waters公司)；AL 204 电子分析天平(梅特勒-托利多仪器公司)；KQ-100E型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；PB-10酸度计(德国Sartorius公司)。

1.3 色谱条件与系统适应性 色谱柱为Wasters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为磷酸盐缓冲液(pH=4.5)∶乙腈 (52∶48，v/v)；检测波长252 nm； 流速1 mL/min；柱温30 ℃。

1.4 溶液配制

1.4.1 对照品溶液配制 精密称取2.5 mg德拉昔布标准品，1 mL甲醇溶解，定容至250 mL容量瓶制成含德拉昔布0.01 mg/mL的溶液，作为对照品贮备液。

1.4.2 供试品溶液配制 分别取标示量为25 mg德拉昔布咀嚼片和Deramaxx，充分研碎，加入适量甲醇定容至250 mL容量瓶中作为供试品储备液，超声处理20 min，取2 mL供试品贮备液以3 000 r/min离心10 min，精密吸取上清1 mL供试品储备液定容至25 mL容量瓶中，作为供试品。

1.5 专属性 按德拉昔布咀嚼片处方压出空片(不含主药德拉昔布，使用等量淀粉替代)，按1.4.2方法制成空白辅料溶液，另分别取标示量25 mg的德拉昔布咀嚼片和Deramaxx，同样按1.4.2方法处理，样品经0.22 μm滤膜滤过后，取上述溶液各10 μL， 注入HPLC，记录色谱图与峰面积。

1.6 HPLC测定的方法学研究[10]

1.6.1 线性关系 精密称定德拉昔布标准品25 mg，按1.4.1方法操作，稀释成0.01 mg/mL对照品储备液，分别取0.5、1、2、4 mL和8 mL储备液，以甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成含量分别为0.5、1、2、4 μg/mL和8 μg/mL一系列浓度的德拉昔布标准品溶液，分别取10 μL注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标作图并进行回归分析，应用SPSS 22.0建立标准曲线并进行相关性分析。

1.6.2 仪器精密度 按1.4.1方法制成对照品贮备液，取对照品溶液储备液4 mL定容到10 mL容量瓶中，配成含量为4 μg/mL的德拉昔布，取10 μL注入HPLC，连续进样6次，记录色谱图与峰面积。

1.6.3 重复性 日内重复性：按1.4.2方法分别平行配置供试品5份，各取10 μL在同天进样，记录色谱图与峰面积。日间重复性：按1.4.2方法分别在5 d内每天配制供试品一份，每次进样10 μL，记录色谱图与峰面积。

1.6.4 灵敏度 按1.4.1方法配制对照品贮备液，逐步稀释进行检测，以Empower 2软件建立的处理方法计算信噪比，依据信噪比在3左右时，确定检测限(Limit of detection，LOD)，依据信噪比在10左右时，确定定量限(Limit of quantification，LOQ)。

1.6.5 溶液稳定性 按1.4.1方法配置好对照品，分别在0、2、4、8、16 h和24 h测定对照品的含量变化，评价德拉昔布在甲醇溶剂中的稳定性。

1.6.6 回收率 采用加样回收率测定法，精密称定德拉昔布咀嚼片适量，按1.4.2方法平行配制供试品3份，分别按已知对照品含量的80%、100%和120%精密添加德拉昔布标准品，各取10 μL注入HPLC，重复3次上述操作，记录色谱图与峰面积。

1.7 耐用性[11]将方法的流动相比例，磷酸盐缓冲液pH，流速与柱温进行微小改变，考察细微的色谱条件变化对含量测定结果的影响，精密称定已知含量的德拉昔布标准品，按1.4.1方法配制，进样10 μL，记录色谱图与峰面积。

1.8 含量测定 选取不同批次的德拉昔布咀嚼片与Deramaxx，按1.4.2方法配制供试品，以建立的德拉昔布咀嚼片含量测定法测定，进样10 μL，记录色谱图与峰面积。

2 结果

2.1 专属性 专属性结果如图1～3所示，德拉昔布保留时间约为10.9 min，空白辅料不会对主药德拉昔布峰产生干扰，表明该方法的专属性良好。

图1 空白辅料液相色谱图Fig.1 The liquid chromatogram of blank excipients

图2 德拉昔布咀嚼片液相色谱图Fig.2 The liquid chromatogram of deracoxib chewable tablets

图3 Deramaxx液相色谱图Fig.3 The liquid chromatogram of Deramaxx

2.2 HPLC测定的方法学研究 结果见表1。经SPSS 22.0处理数据得到样品浓度C(Concentration)与峰面积A(Peak area)的回归方程A=31 577C+3 514.7 (r2=0.999 2)，经回归分析得到Sig<0.01，峰面积与浓度显著相关，说明在0.5～8 μg/mL的浓度范围内，德拉昔布的浓度与峰面积显著相关，且相关性良好。建立的HPLC法检测德拉昔布的检测限与定量限分别为0.051 μg/mL和0.16 μg/mL；方法的平均回收率为(99.68±0.53)%，符合回收率规定在98%～102%，RSD<2%；日内与日间重复性分别为0.94%和1.85%，均<2%，符合有关规定；仪器精密度结果为0.56%<2%，表明仪器精密度良好，其结果可信；溶液稳定性结果为0.57%<2%，表明德拉昔布24 h以内在甲醇溶剂中稳定。经过以上方法学考察，证明该检测方法可行。

表1 HPLC法检测德拉昔布咀嚼片的方法学考察Table 1 The validation of HPLC for the determination of deracoxib chewable tablets

2.3 耐用性 结果见表2。经细微改变流动相比例，磷酸盐缓冲液pH，流速与柱温，考察对含量测定的影响。不同条件下，其含量结果的RSD为0.82%，说明细微的条件改变对含量结果基本无影响，方法耐用性良好。

表2 HPLC法检测德拉昔布咀嚼片的条件耐用性Table 2 Robustness of the HPLC method for determination of deracoxib chewable tablets

2.4 3批样品的含量测定 含量测定结果见表3。3批样品的含量均在90%～110%，符合兽药典关于片剂含量的要求。

表3 不同批次的德拉昔布咀嚼片含量Table 3 Content of deracoxib chewable tablets in different batches

3 讨论

关于波长选择，对德拉昔布进行全波长扫描，发现252 nm处，吸收值较大，有关物质也有一定吸收，但辅料在此波长下无吸收。从而确定在252 nm处测定德拉昔布的含量。

关于溶剂的选择，因为德拉昔布难溶于水，易溶于DMSO，可溶于甲醇、乙腈，所以分别对3种溶剂进行考察，3种溶剂对于有关物质以及含量影响不大，所以最终选择价格比乙腈、DMSO便宜的甲醇作为溶剂。

关于流动相的选择，最开始使用水与乙腈作为流动相，经过适当比例调整后，发现峰型不理想，于是把水换成不同pH磷酸盐缓冲液进行考察[12]，发现pH为4.5时，德拉昔布主峰的峰型最好，经过适当的比例调整，最终确定流动相为磷酸盐缓冲液(pH=4.5)∶乙腈(52∶48，v/v)。

样品的溶解超声时间确定，德拉昔布咀嚼片被粉碎后，用甲醇溶解，超声粉碎处理。为考察超声时间的影响，分别超声10、20 min和30 min考察对含量测定的影响[13]，在既保证德拉昔布完全从辅料中释放溶解，又保证工作效率的前提下，超声时间最终定为20 min。

德拉昔布作为一款还未在我国上市的犬类专用环氧酶抑制剂，建立稳定、有效的含量测定方法对于今后德拉昔布质量标准的制定可以提供理论依据。所建立的方法专属性强，准确度高，重现性好，符合相关要求，可用于德拉昔布咀嚼片的含量测定。