脂多糖致小鼠急性肺损伤模型给药剂量和时间的筛选

王显峰，白萨日娜

(1.扎兰屯职业学院，内蒙古 扎兰屯 162650 ； 2.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

急性肺损伤(Acute lung injury，ALI)是指各种直接或间接因素所致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，大量蛋白液积聚造成急性肺水肿，导致严重的急性呼吸衰竭，影像学表现是两肺渗出性病变，氧合指数<300[1]。急性肺炎是肺炎、败血症、创伤等引起的肺部炎症之一，在ALI中，中性粒细胞是炎症和发病机理的主要参与者，因此，当肺脏发生炎性病变时，外周血中大量的白细胞，尤其是中性粒细胞会聚集在患病部位，在肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和病理组织样本中有大量的多形核中性粒细胞，而外周血中的中性粒细胞(Polymorphonuclear，PMN)减少[2]。国内外研究人员一般采用气管滴入或腹腔注射脂多糖制造小鼠急性肺损伤模型[3-4]，本试验采用了对小鼠创伤较小的滴鼻方式，系统地比较了不同时间、不同脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)浓度的最适造模条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本试验选用清洁级昆明小鼠，雄性，48只，6～8周龄，18～22 g，由内蒙古大学国家清洁级实验动物繁育室提供。

1.2 试验分组与设计 小鼠试验前禁食12 h，自由饮水。将小鼠随机分成8组，每组6只，分别为造模剂量组、造模时间组和空白对照组(Control)。造模剂量组每只小鼠滴鼻剂量分别为1、2 mg/(kg·bw)和5 mg/(kg·bw)的脂多糖，滴鼻6 h后取样。造模时间组分别于滴鼻后6、12、24 h和48 h进行取样，给药剂量均为2 mg/(kg·bw)。空白对照组小鼠滴鼻等体积0.9%NaCl。试验分别取每组每只小鼠肺灌洗液用来检测TNF-α、IL-6、IL-1β含量，取小鼠外周血镜下计算中性粒细胞数量，取左肺计算湿干重比，取右肺做病理切片。

1.3 试验材料 脂多糖LPS(46M4045V)，购自美国Sigma公司；IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA检测试剂盒，均购自美国eBioscience公司；酶标板，购自美国康宁有限公司；苏木素-伊红染液及其他试剂，均购自南京建成生物科技有限公司。

1.4 肺组织切片及苏木精-伊红染色 取部分小鼠右肺组织，置入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定12 h，常规石蜡包埋，连续切片，以中性树胶封片。

1.5 肺湿干重比计算 取完整小鼠左肺，用滤纸吸取肺组织表面的血液，干燥称量纸上称得湿重(W)，置72 ℃恒温箱，烘烤48 h后称量干重(D)，以湿干重比(W/D)表示肺组织含水量。

1.6 细胞因子的测定 采用ELISA方法测定小鼠肺灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，按照试剂盒说明书步骤进行操作，在吸光度560 nm处用酶标仪检测其含量，记录数据。

1.7 中性粒细胞(PMN)百分比 取适量小鼠外周血，做血涂片后用瑞氏-吉姆萨染色液染色，晾干后进行细胞计数，中性粒细胞百分比(PMN%)=中性粒细胞总数/白细胞总数×100%。

1.8 数据统计与分析 所有数据需要进行统计学分析，使用SPSS Statistics 17.0软件对数据进行方差分析。

2 结果

2.1 小鼠临床症状 本试验模型各组小鼠均出现明显精神沉郁，食欲减退现象。其中造模6 h、9 h组和给药剂量1、2、5 mg/(kg·bw)组小鼠出现群聚，个别小鼠出现呼吸频率增加，尤其是5 mg/(kg·bw) 组小鼠呈现精神萎靡，团索一起，饮食废绝，体重明显减轻；12 h组小鼠后期基本恢复正常。

2.2 肺组织病理形态学观察 如中插彩板图1所示，从病理切片结果显示，按炎症分级情况进行病理学评定：空白对照组小鼠肺组织形态完整，肺泡壁薄，肺泡腔内无渗出物，肺泡结构完整(封底彩版图1A)；3、6、9 h组和12 h组小鼠肺组织结构均出现不同程度模糊，肺泡腔内可见炎性细胞浸润，巨噬细胞增多，肺泡间隔明显增厚，肺部炎症明显(封底彩版图1B、1C、1D、1E箭头)，尤其以6 h组和9 h 组最严重(封底彩版图1C、1D)；1 mg/(kg·bw)组肺部炎症程度较轻，见少量炎症细胞浸润，气管结构完整，支气管黏膜下无大量淋巴细胞浸润(封底彩版图1F箭头)；2、5 mg/(kg·bw)组肺部炎症较明显(封底彩版图1G和1H箭头)。

图1 小鼠肺脏组织病理学检测 (H.E.染色，100×)Fig.1 Mice lung tissues detected by histopathology (H.E. staining,100×)A：空白对照组； B：3 h组； C：6 h 组； D：9 h 组； E:12 h 组； F：1 mg/(kg·bw)组； G：2 mg/(kg·bw)组； H：5 mg/(kg·bw)组A:Blank control group; B:3 h group; C:6 h group; D:9 h group; E:12 h group; F:1 mg/(kg·bw) group;G:2 mg/(kg·bw) group; H:5 mg/(kg·bw) group

2.3 肺组织湿干重比 造模时间组小鼠于滴药后3、6、9 h和12 h肺组织湿干重比明显高于空白对照组，其中6 h组小鼠肺组织湿干重比显著高于空白对照组(P<0.05)，见表1。2、5 mg/(kg·bw)组小鼠肺组织湿干重比极显著高于对照组(P<0.01)，见表2。

表1 小鼠急性肺损伤不同造模时间肺湿干重比Table 1 Lung wet and dry weight ratio of mice with acute lung injury at different modeling times

表2 不同造模浓度肺湿干重比Table 2 Lung wet and dry weight ratio at different modeling concentrations

2.4 急性肺损伤模型时间及浓度筛选 造模时间组小鼠滴药后6、9 h和12 h肺组织IL-6、TNF-α和IL-1β水平极显著高于空白对照组(P<0.01)，其中6 h组肺组织IL-6、TNF-α和IL-1β水平高于其他各组，如表3所示。脂多糖2、5 mg/(kg·bw)组小鼠肺组织IL-6、TNF-α和IL-1β水平极显著高于空白对照组(P<0.01)，如表4所示。

表3 不同造模时间细胞因子的表达水平Table 3 The expression level of cytokines at different modeling times

表4 不同造模浓度细胞因子的表达水平Table 4 The expression level of cytokines at different modeling concentrations

2.5 中性粒细胞百分比 中性粒细胞百分比结果见表5和表6。造模时间各组PMN百分比均明显低于空白对照组，其中3 h组PMN百分比显著低于空白对照组(P<0.05)，6、9 h组和12 h组PMN百分比极显著低于空白对照组(P<0.01)，如表5所示。造模浓度各组PMN百分比均明显低于空白对照组，其中1 mg/(kg·bw)组PMN百分比显著低于空白对照组(P<0.05)，2、5 mg/(kg·bw)组PMN百分比极显著低于空白对照组(P<0.01)，如表6所示。

表5 不同造模时间PMN百分比Table 5 PMN percentages at different modeling times

表6 不同造模浓度PMN百分比Table 6 PMN percentages at different modeling concentrations

3 讨论

急性肺损伤(ALI)致病因素较多，其致死率颇高，但目前临床上特效药较少，其发病机制也尚未明确。目前小鼠、大鼠是研究ALI最常见的实验动物[5]。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞壁中的一种成份，只有在细菌死亡、繁殖或人工破坏时，才会释放到细胞外，发挥其各种效应。由于脂多糖对宿主有一定的毒性，因此，也叫做内毒素，在科学研究上常作为诱导物，用于小鼠、大鼠急性肺炎模型的建立[6-7]。临床上常用尾静脉注射药物、腹腔注射药物、气管滴入药物以及盲肠结扎穿刺方法建立急性肺损伤模型，王婷等[8]通过试验比较上述几种方法发现，腹腔注射药物和气管滴入更适合ALI模型的建立。本试验采用对动物机体刺激较小的气管滴入方法，在此基础上改进具体滴药模式，将滴入剂量分3次滴入发现效果更好。据现有关于ALI模型条件筛选的报道，笔者发现部分学者只筛选时间[9]，对于单独筛选LPS浓度的研究未见报道，目前临床常用LPS造模浓度为10[10]、5 mg/(kg·bw)[11]和2 mg/(kg·bw)[12]。本试验在各种因素相同条件下同时造模筛选时间和LPS浓度，更加符合ALI模型建立的实际情况。

本试验采用鼻孔滴注方法，设置了造模剂量组[1、2 mg/(kg·bw)和5 mg/(kg·bw)]和造模时间组(3、6、9 h和12 h)旨在建立小鼠ALI模型最佳条件，本试验通过测定ALI的典型指标，病理组织变化、肺干湿重、炎症因子水平，来综合评价ALI模型是否成功。试验结果显示，当LPS浓度为2 mg/(kg·bw)， 造模时间为6 h时，炎症因子表达量最高且肺湿干重比最明显，中性粒细胞也极显著减少，小鼠肺脏病理切片可见明显炎性病变，视为最佳造模条件。尽管LPS造模9 h、浓度5 mg/(kg·bw) 炎症因子表达量、肺湿干重比、PMN百分比等指标与空白对照组相比也有显著差异，但综合小鼠临床状态表现，上述条件不适合作为ALI模型的最佳条件。