SOX9腺病毒过表达载体的构建及其对犬ADSCs向胰岛样细胞分化的影响

高登科，戴鹏秀，范志新，张 霞，阮晨梅，王璟璐，张欣珂，张翊华

(西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100)

糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤之后危害人和动物身体健康的第三大疾病，是犬常见的高发内分泌疾病，患病犬通常会出现高血糖和糖尿，并表现出多饮、多尿、多食和体重减轻等临床症状[1]。虽然外源性胰岛素治疗可以控制糖尿病的血糖升高，但无法防止血糖波动引起的微血管病变及并发症[2]。胰岛移植是治疗胰岛素依赖性糖尿病的理想方法，但因供体缺乏和免疫排斥而受阻[3]。因此，寻找一种更加高效、安全的糖尿病治疗方法是目前医学亟待解决的问题。

脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)具有多向分化潜能，其不仅来源广泛，易于分离培养，而且移植后免疫原性低，对受体的淋巴细胞还具有免疫抑制能力，是治疗自身免疫损伤性糖尿病的理想种子细胞[4]。SOX9是内胚层发育和分化时期胰腺祖细胞的标志物之一，其对于维持胰腺祖细胞状态是必需的。McDonald等[5]研究发现，人胚胎胰岛上皮细胞敲除SOX9基因后胰岛素阳性细胞大量丢失，随后进一步试验发现，SOX9是以剂量依赖的方式调控祖细胞扩增、β细胞分化的，并且SOX9基因的表达量可以反映胰岛细胞增殖能力。但到目前为止，SOX9在ADSCs向胰岛样细胞分化过程中是否具有重要作用还是一个未知数。因此，本试验构建了腺病毒过表达重组载体pAdTrack-SOX9-AdEasy，并用获得了具有感染性的腺病毒毒液感染犬ADSCs ； 随后通过检测感染后的绿色荧光蛋白表达情况、细胞形态变化和胰岛β细胞发育相关基因的表达情况，探讨SOX9基因的过表达对犬ADSCs向胰岛样细胞分化的影响和意义，为进一步获得有功能的胰岛β细胞提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 犬ADSCs由陕西省干细胞工程技术研究中心分离、鉴定和保存[6]；293A细胞由西北农林科技大学动物医学院外科实验室保存；pAdTrack-CMV、Stbl3、BJ5183-AD-1，均购自北京华越洋生物科技有限公司；EasyGeno快速重组克隆试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；BglⅡ酶、Hind Ⅲ酶、PacI酶、PmeI酶，均购自New England Biolabs公司；Advanced Transfection Reagent，购自ZETA LIFE公司。

1.2 pAdTrack-CMV-SOX9的构建 通过全基因组合成技术，由武汉金开瑞生物工程有限公司合成SOX9基因的CDS序列(SOX9 Gene ID:403464)，设计引物：SOX9-1F、SOX9-1R(表1，上、下游引物与腺病毒表达载体pAdTrack-CMV的BglⅡ、Hind Ⅲ 处分别有20 bp的重叠区域)。PCR扩增SOX9基因，pAdTrack-CMV经BglⅡ和Hind Ⅲ 双酶切，经过胶回收和测序鉴定，得到SOX9基因片段和线性化载体。根据EasyGeno快速重组克隆试剂盒说明书连接SOX9基因片段和线性化载体。连接产物经Stbl3感受态细胞转化后，进行质粒的提取，对得到的质粒pAdTrack-CMV-SOX9进行PCR和双酶切鉴定。

1.3 重组腺病毒质粒的制备和腺病毒的包装与检测 pAdTrack-CMV-SOX9、pAdTrack-CMV经PmeⅠ单酶 切线性化后，于BJ5183-AD-1感受态细胞(含有质粒pAdeasy-1)中进行重组。对得到的质粒pAdTrack-SOX9-AdEasy、pAdTrack-0-AdEasy使用PacⅠ单酶切鉴定，回收鉴定正确的线性化片段。按照Advanced Transfection Reagent说明书于293A细胞中转染，获得第1代腺病毒毒液，再次感染293A细胞，以大量扩增腺病毒，对第4代腺病毒毒液滴度进行测定。利用特异性引物SOX9-2F、SOX9-2R和GADPH-F、GADPH-R(表1)对感染pAdTrack-SOX9-AdEasy、pAdTrack-0-AdEasy的293A细胞及未感染的293A细胞进行目的基因的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测。

1.4 体外培养犬ADSCs向胰岛样细胞分化及相关基因的RT-qPCR检测 第3代犬ADSCs以1×105个/mL 接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞长至60%，按感染复数(MOI)等于100进行感染，37 ℃、5% CO2培养箱孵育1 h后，加入500 μL含10% FBS的α-MEM培养基；在感染4、7、10、13 d和16 d后，倒置荧光显微镜下观察犬ADSCs中绿色荧光蛋白的表达情况以及细胞的形态变化，并分别进行细胞样品的收集。通过Primer Premier 6.0对Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD1、Pax4、Gata4、PCSK1、PCSK2、Insulin等进行引物设计(表1)，进行RT-qPCR检测。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 结果

2.1 pAdTrack-CMV-SOX9载体的构建 利用PCR技术，获得含有BglⅡ和Hind Ⅲ特定酶切位点的SOX9基因片段(1 582 bp，图1A)，经测序验证SOX9基因片段扩增正确。将得到的SOX9片段与线性化载体pAdTrack-CMV连接，得到pAdTrack-CMV-SOX9质粒，经过BglⅡ和Hind Ⅲ 双酶切和PCR鉴定(图1B)，结果均与预期大小相符，成功构建pAdTrack-CMV-SOX9载体。

2.2 腺病毒过表达重组载体的构建 线性化载体pAdTrack-CMV-SOX9、pAdTrack-CMV于BJ5183-AD-1感受态细胞中重组，分别获得pAdTrack-SOX9-AdEasy和pAdTrack-0-AdEasy。经PacI单酶切鉴定，均得到大小约为30 kb和5 kb的2条条带(图1C)，证明成功构建腺病毒过表达重组载体pAdTrack-SOX9-AdEasy和pAdTrack-0-AdEasy。

图1 pAaTrack-CMV-SOX9重组腺病毒载体的构建Fig.1 Construction of recombinant adenovirus vector pAaTrack-CMV-SOX9A：SOX9基因的克隆(M：1 kb plus DNA marker； 1：SOX9基因片段)； B：pAdTrack-CMV-SOX9载体的鉴定(M：D15 000 DNA marker；1：pAdTrack-CMV双酶切产物； 2：pAdTrack-CMV-SOX9双酶切产物； 3：SOX9 PCR扩增产物)； C：重组腺病毒表达载体Pac I酶切鉴定(M：D15 000 DNA marker； 1：pAdTrack-SOX9-AdEasy Pac I酶切产物； 2：pAdTrack-0-AdEasy Pac I酶切产物)A:Clone of the SOX9 gene (M:1 kb plus DNA marker; 1:SOX9 gene fragments); B:Identification of pAdTrack-CMV-SOX9 vector (M:D15 000 DNA marker; 1:pAdTrack-CMV bienzyme cutting products; 2:pAdTrack-CMV-SOX9 bienzyme cutting products; 3:SOX9 PCR amplification products); C:Recombinant adenovirus expression vector Pac I enzyme identcfication (M:D15 000 DNA marker;1:pAdTrack-SOX9-AdEasy Pac I enzyme cut products; 2:pAdTrack-0-AdEasy Pac I enzyme cut products)

2.3 腺病毒的包装、滴度测定和过表达效果检测PacI单酶切pAdTrack-SOX9-AdEasy、pAdTrack-0- AdEasy，回收线性化产物分别转染至293A细胞中，24 h后可观察到绿色荧光蛋白表达，48 h后满视野细胞均可见绿色荧光表达(见中插彩版图2A～2D)。持续培养6～7 d后，获得第1代腺病毒毒液，经过扩增，对第4代腺病毒毒液进行滴度测定，SOX9基因过表达腺病毒毒液滴度为5.375×1010TU/mL， 空载体腺病毒毒液滴度为5.875×1010TU/mL。 将2个腺病毒毒液感染293A细胞，SOX9过表达腺病毒组的SOX9基因表达水平(20 797.35 ±3 543.34)相对于阴性对照(1±0.059 9)和空载体对照(1.822 9±0.004 2)升高极显著(P<0.001，见中插彩版图2E)，表明成功获得SOX9基因过表达腺病毒毒液。

图2 腺病毒表达载体的包装及过表达效果检测Fig.2 Adenovirus expression vector packaging and overexpression effect detectionA、B：SOX9基因腺病毒表达载体在293A细胞中包装24 h、48 h荧光图(100×)； C、D：空载体腺病毒在293A细胞中包装24 h、48 h荧光图(100×)； E：SOX9基因在293A细胞内相对表达量；与pAdTrack-0-AdEasy组比较，***： P<0.001A、B:SOX9 gene adenovirus expression vector in 293A cells packaging 24 h,48 h fluorescence map(100×); C、D:Empty carrier adenovirus in 293A cells packaging 24 h,48 h fluorescence map(100×); E:Relative expression of SOX9 gene in 293A cell；Compare to the pAdTrack-0-AdEasy group,***: P<0.001

2.4 腺病毒毒液感染犬ADSCs效果观察 使用SOX9基因过表达腺病毒感染犬ADSCs，感染4 d后观察到有绿色荧光蛋白表达，荧光强度较弱(见中插彩版图3A1、3a1)；感染7 d后细胞开始变圆，荧光强度增强(见中插彩版图3A2、3a2)；感染10 d后大部分细胞分化变圆，荧光表达情况依然很好(见中插彩版图3A3、3a3)；感染13 d后细胞开始出现聚集生长，胰岛样细胞团出现，同时随着细胞增殖，腺病毒被稀释出现衰减，荧光开始减弱(见中插彩版图3A4、3a4)；感染16 d后胰岛样细胞团数量增加，只有个别细胞出现荧光(见中插彩版图3A5、3a5)。空载体腺病毒毒液感染犬ADSCs后的荧光情况与SOX9基因过表达腺病毒毒液感染犬ADSCs的情况相似(见中插彩版图3B1～3B5、3b1～3b5)，并在13 d时细胞开始出现死亡，但未出现成团现象。以上结果表明，SOX9基因过表达腺病毒毒液感染犬ADSCs后，提高了犬ADSCs向胰岛样细胞分化的效率。

图3 腺病毒毒液感染犬ADSCs的荧光鉴定(100×)Fig.3 Fluorescence identification of adenovirus venom infection canine ADSCs (100×)A1～A5/a1～a5：SOX9基因过表达腺病毒毒液感染犬ADSCs后第4、7、10、13天和第16天的明场图/荧光图，红色箭头所指为胰岛样细胞团； B1～B5/b1～b5：空载体腺病毒毒液感染犬ADSCs后第4、7、10、13天和第16天的明场图/荧光图A1～A5/a1～a5:The bright field images and fluorescence images of SOX9 overexpressed adenovirus venom infected canine ADSCs on day 4,7,10,13 and 16,the red arrow refers to islet-like cell clusters; B1～B5/b1～b5:The bright field images and fluorescence images of empty carrier adenovirus venom infected canine ADSCs on day 4,7,10,13 and 16

2.5 体外培养犬ADSCs向胰岛样细胞分化相关基因的RT-qPCR检测 为进一步检测SOX9基因在犬ADSCs向胰岛样细胞分化中的作用，进行了相关基因的表达水平检测。如中插彩版图4所示，SOX9腺病毒感染犬ADSCs后，Pdx1、MafA、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2的转录水平显著上升，分别高达阴性对照的316.77、183.19、651.58、27.71倍和51.45倍；并且Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Pax4和Gata4的转录水平也均较空载体腺病毒感染细胞小幅度上升。此外，从诱导时间上看，短期(4、7 d和10 d)感染情况下，SOX9腺病毒可通过外源性刺激提高Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、Pax4、Gata4和PCSK1的基因转录水平，从而影响犬ADSCs向胰岛样细胞的分化过程。在腺病毒感染犬ADSCs后第13天或第16天时，SOX9的外源性刺激作用逐渐减弱，然而一些基因表达水平仍很高。特别是SOX9腺病毒感染第16天时Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2的mRNA水平仍接近最高水平，说明SOX9长期刺激后可通过影响Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2的内源性转录进而调控犬ADSCs向胰岛样细胞的分化。

图4 胰岛发育相关基因的RT-qPCR检测结果Fig.4 RT-qPCR test results of genes related to islet developmentA/B：SOX9基因过表达/空载体腺病毒毒液感染犬ADSCs后分别在4、7、10、13 d和16 d检测相关基因的mRNA表达量；*:P<0.05，有统计学差异；**:P<0.01，有显著统计学差异；***:P<0.001，有极其显著的统计学差异A/B：The test results of the relevant gene mRNA expression respectively on the 4th,7th,10th,13th,16th days after canine ADSCs were infected with SOX9 gene overexpression/empty carrier adenovirus venom；*:P<0.05,statistical differences;**:P<0.01,significant statistical differences;***:P<0.001,extremely significant statistical differences

3 讨论

胰岛β细胞替代治疗作为一种非常有前景的治疗方法正受到越来越多的关注。ADSCs具有来源丰富、易分离、易扩增和无伦理学争议等优点，成为诱导分化成β细胞的重要种子细胞资源。而且，与其他间充质干细胞相比，ADSCs中含有瘦素、脂肪细胞因子、内脂素等[7]，具有调节血糖平衡作用的生物活性物质。因此，ADSCs作为治疗糖尿病的种子细胞来源更具有优势。之前已有大量研究表明，ADSCs能够定向诱导分化为胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells，IPCs)，并且分化后的细胞具有降低血糖的功效，但得到IPCs的比例相对较低，且细胞分泌胰岛素的功能仍有待完善[8-10]。腺病毒载体介导的细胞转染技术相比于常规的物理和化学介导的细胞转染方法具有较好的转染效率，在感染复数(MOI)等于100时，感染率可达到70%，且对细胞增殖能力没有显著影响[11]。SOX9是控制生长发育基因家族SOX中的一员，属于核转录因子，是胰腺发育过程调控网络中的多潜能因子。研究表明，SOX9与Notch、Wnt、Fgf信号通路共同作用参与早期胰腺发育与晚期内分泌细胞分化，其功能缺失可以导致胰腺发育不全和祖细胞池枯竭[12]。Dubois等[13]研究发现，SOX9基因功能缺失可以导致小鼠血糖发生变化。但SOX9基因在ADSCs向胰岛β细胞分化过程中是否具有重要作用还是一个未知数。因此，为探讨SOX9基因在ADSCs向胰岛样细胞分化过程中的作用，本试验将犬ADSCs多向分化潜能与腺病毒在基因传递过程中的优越性相结合，应用腺病毒携带SOX9诱导犬ADSCs向胰岛样细胞分化，观察细胞形态变化。结果显示，SOX9诱导犬ADSCs后在第13天和第16天出现了细胞聚集生长现象，且细胞团数不断增加。这在一定程度上可以说明SOX9的诱导能有效促使犬ADSCs成团生长，促进犬ADSCs向胰岛样细胞分化。

近年来，胰腺发育相关基因在胰岛β细胞发育成熟中的作用不断被报道。其中，Pdx1基因在胚胎发育过程中能促进胰腺的早期发育和晚期胰岛素分泌细胞分化，在成体中能帮助维持胰岛β细胞的形态和功能，是β细胞的主要调控因子[14]。Ngn3主要在胚胎发育期的胰腺、神经管和下丘脑组织表达，是胚胎时期决定胰腺内分泌细胞命运的重要因子[15]。Mnx1编码同源域转录因子，在背部胰腺原基中Pdx1的表达之前，于背侧和腹侧肠内胚层中表达[16]。MafA是一种胰岛β细胞特异性转录因子，只在β细胞中调控胰岛素基因的表达[17]。Nkx2.2是最初表达于发育时期胰腺胚芽的基因，其可促使胰腺祖细胞向内分泌细胞方向分化[18]。Nkx6.1对于胰腺β细胞形成非常重要，Nkx6.1突变胰腺成熟β细胞完全缺乏，而α细胞发育正常[19]。PCSK1和PCSK2编码的前蛋白转化酶1和2是胰岛素原加工为胰岛素的关键酶[20]。在本试验中发现，SOX9诱导犬ADSCs后，在第16天时腺病毒虽然被稀释衰减，但Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2等基因仍有较高的表达量，提示出现了内源性表达。NeuroD1、Pax4和Gata4的表达量较其他基因来说相对较低，这可能是由于SOX9的外源性刺激对这3个基因的影响较弱未能引起内源性表达；Insulin基因的不表达说明细胞仍未发育为成熟的胰岛β细胞，而只是分化为胰岛样细胞，可能还需要其他因子的共同作用，具体原因还有待于进一步研究。

本试验所构建的重组SOX9腺病毒提供了良好的转基因工具，其转染犬ADSCs能够诱导Pdx1、Ngn3、Mnx1、MafA、Nkx2.2、Nkx6.1、PCSK1和PCSK2 等基因出现内源性表达，并能有效促进犬ADSCs成团生长，这为ADSCs进一步分化成为胰岛素分泌细胞提供试验依据。