啤酒酵母-花生粕酶解制备鲜味肽的研究

胡美欣，杨志伟

（广西大学轻工与食品工程学院广西高校特色农产品精深加工与安全控制重点实验室，广西 南宁 530004）

啤酒酵母中蛋白质含量丰富，占整体干重的50%左右，具有较高的利用价值。由其制备的酵母抽提物在国外被誉为第三代味精。花生粕是以脱壳花生果为原料，经提取油脂后的副产品。花生粕富含蛋白质[1]、维生素和矿物质，具有较高的营养价值，其蛋白含量高达40%～50%，氨基酸组成比较合理，且其氨基酸组成中鲜味氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）含量高达32%，是优良的鲜味肽生产原料。花生粕因其含硫氨基酸蛋氨酸（methionine，Met）、半胱氨酸（cysteine，Cys）和赖氨酸（lysine，Lys）含量极低[2]，被认为是花生中主要的限量氨基酸，但通过与其它蛋白原料如Lys含量可观的啤酒酵母适当搭配，具有较高的营养价值[3-4]。利用农产品加工的副产物花生粕和啤酒酵母结合[5-6]，不仅丰富了产品营养、充分利用了附加值低的农副产品，也简化了生产工艺，为探索新鲜味呈味基料提供了重要的研究途径。

本试验以啤酒酵母和花生粕混合组分为原料，通过超声预处理后用商业蛋白酶进行酶解，得到最优酶解条件，以期为后续酶解制备鲜味产品的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒酵母：湖南仁恒生物科技有限公司；花生粕：市售。

氢氧化钠、盐酸、硫酸、甲醛（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；磺基水杨酸（优级纯）：天津市大茂化学试剂厂；碱性蛋白酶（20万U/g）、胰蛋白酶（25万 U/g）、复合蛋白酶（10万 U/g）、风味蛋白酶（3万U/g）：北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、柠檬酸、亮氨酸、谷氨酸钠、谷胱甘肽（均为食品级）：市售。

1.2 仪器与设备

KDN-20C型消化炉、KD-2N型凯氏定氮仪：浙江托普云农科技股份有限公司；PHSJ-4F实验室pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SHZ-88水浴恒温振荡器、HH-S6数显恒温水浴锅、HJ-3控温磁力搅拌器：江苏金怡仪器科技有限公司；JAC-300N型数控超声波清洗机：山东省济宁市奥波超声电气有限公司；L8900型全自动氨基酸分析仪：日本Hitachi公司；TLE204E分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Waters 1525高效液相色谱：美国沃特斯公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工艺流程

将花生粕粉碎过60目筛，将啤酒酵母粉和花生粕按质量比1∶1混合进行试验。在风味蛋白酶、复合蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶的最适温度和pH值条件下，采用料液比 1∶12（g/mL），时间 8 h，加酶量 1%对 4种蛋白酶进行筛选，用选出来的酶进行下一步单因素试验。

单因素试验设计如下：用去离子水将样品分别按料液比 1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18（g/mL） 对原料进行溶解，加蒸馏水后进行功率为300 W，时间为25 min的超声预处理，结束后用NaOH和HCl溶液调节溶液pH值分别为 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 后加入蛋白酶，加酶量为0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%，酶解期间每2 h调节一次pH值。将样品在振荡水浴锅温度为45、50、55、60、65 ℃下将样品反应 4、8、12、16、20 h，反应结束后于95℃下灭酶15 min，冷却至室温（25℃）后在8 000 r/min下离心15 min，取上清液待测。单因素以蛋白回收率、水解度和感官评价为指标进行分析。

以上述单因素试验结果为基础，以温度、时间和加酶量为三因素，蛋白回收率为指标进行正交试验，正交试验因素与水平设计见表1。

表1 L9（34）正交试验因素与水平设计Table 1L9（34）Orthogonal experimental factors and horizontal design

1.3.2 检测指标

1.3.2.1 蛋白回收率（protein recovery，PR）测定方法

取蛋白酶解上清液，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定上清液中蛋白质含量。具体计算公式如下。

蛋白质回收率/%=酶解产物上清液中蛋白含量/原料蛋白含量×100

1.3.2.2 水解度（degree of hydrolysis，DH）测定

水解度采用甲醛电位滴定法测定[7]，水解度计算公式如下。

水解度（DH）/%=酶解产物上清液中氨态氮含量/原料总氮含量×100

1.3.2.3 感官评价

参照苏国万[8]的方法并稍做修改，感官评定小组由9人组成（4名男士，5名女士，年龄20岁～35岁之间），房间温度为（25±2）℃，品评前已对品评人员进行鲜、咸、苦、酸、厚重感5种味觉识别、排序的培训。品评结果采用评分法，分值分别为0～5分，分值0代表无，分数5代表极强。标准品分别为味精（0.35%）、氯化钠（0.35%）、亮氨酸（0.01%）、柠檬酸（0.08%）和谷胱甘肽（0.04%），最终结果取9人评定值的平均值。

1.3.2.4 肽分子量分布测定

称取待测样品100 mg左右置于10 mL容量瓶中[9]，用流动相乙腈/水/三氟乙酸（40/60/0.1，体积比）稀释定容，用滤膜过滤后待测，柱温为30℃，流速为0.5 mL/min，在220 nm下测量样品的肽分子量分布。分子量校正曲线所用标准品为：细胞色素C（分子量12 384 Da），抑肽酶（分子量 6 500 Da），杆菌酶（分子量1 422 Da），乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451 Da），乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量 189 Da）。

1.3.2.5 游离氨基酸测定

准确称量冻干样品，用磺基水杨酸定容至刻度，振荡混合均匀后，4℃下静置2 h，于10 000 r/min下离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜后于氨基酸自动分析仪测定。

1.3 数据分析

每个数据均为3次试验的平均值，采用SPSS 25.0进行方差分析，用origin 9.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 酶种类对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

酶种类对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图1。

图1 酶种类对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.1 Effects of enzyme types on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由1图可知，在4种蛋白酶的处理组分中，碱性蛋白酶的蛋白回收率最高，达到（74.00±1.97）%，其次为胰蛋白酶，回收率为（69.81±0.78）%。4种蛋白酶的水解度相差不大，其中碱性蛋白酶的水解度最低，结果为11.06%。

用不同蛋白酶酶解原料是一种温和且高效的提取蛋白风味物质的方法，内切蛋白酶起到的作用是水解蛋白质中疏水性氨基酸残基，外切蛋白酶除去多肽首尾两端的疏水性氨基酸，造成多肽所含的疏水氨基酸总量减少，并且降低疏水性氨基酸在多肽C-末端所占的比例，从而降低苦味[10]。

由图1的感官评价图可知，风味蛋白酶处理组鲜味最为突出，其次是复合蛋白酶，最差的为碱性蛋白酶。风味蛋白酶鲜味最佳可能因为其含内切酶和端解酶，在酶解过程中内切酶把大分子蛋白酶解成较大分子量的肽，端解酶则把大分子肽酶解成小分子肽或游离氨基酸。其中苦味最明显的是碱性蛋白酶处理组，李学鹏等[11]研究发现碱性蛋白酶解物苦味最强，认为碱性蛋白酶为内切酶，水解后容易产生含亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸等疏水性氨基酸。

综合3个指标，碱性蛋白酶虽然蛋白回收率最高，但苦味最重，对产品风味有着极大不良影响，胰蛋白酶蛋白回收率为第二，且鲜味突出，其中风味蛋白酶感官评价中综合风味最佳，采用风味蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解进行下一步试验。

2.2 双酶复配对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

双酶复配对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图2。

图2 双酶复配对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.2 Effects of double enzyme on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

单一蛋白酶的酶切位点有限，难以达到想要的结果，风味蛋白酶虽风味可观但酶解效率差，胰蛋白酶解效率高，两者结合作用以期达到协同增效的效果[12]。

由图2可知，随着胰蛋白比例的增加，蛋白回收率逐渐增加，但水解度变化不明显。在风味蛋白酶占比高时有着较高的水解度，可能是因为风味蛋白酶占比高时对水解度起到积极作用，当胰蛋白酶比例高时对蛋白回收率影响更大，当风味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（质量比）时，蛋白回收率为（63.28±0.45）%，水解度为（13.65±0.78）%。

从感官评价雷达图可得，鲜味最明显的组为风味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（质量比）。所以综合3个指标，最后选择风味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（质量比）进行下一步试验

2.3 复合酶添加量对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

复合酶添加量对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图3。

图3 复合酶添加量对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.3 Effect of enzyme amount on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由图3可知，随着反应体系中加酶量的增加，蛋白回收率和水解度都呈上升趋势，特别是加酶量从0.2%～0.6%时，两指标都有明显的提升，说明当加酶量为0.2%时，对于反应体系来说酶量远远不够。在加酶量为1.0%时回收率达到最大值（65.36±0.34）%，水解度为（13.94±0.50）%，这与王虹等研究加酶量对鲜味肽的酶解效果相似[13]。当加酶量大于1.0%之后，酶量虽然在增加，但蛋白回收率和水解度趋于平稳，因此可得，加酶量到达一定量后酶量的增加对蛋白回收率和水解度的促进是有限的[14]。

从感官图可得，苦味值最大的组为加酶量1.8%，酶量增加到一定程度会使得苦味增加。鲜味最强的组为0.6%和1.0%组，其次为1.8%组。综合考虑到酶解效果和经济效益，以加复合酶量为1.0%进行下一步试验。

2.4 酶解pH值对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

pH值对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图4。

图4 pH值对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.4 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

蛋白酶对pH值较为敏感，当在其适合的pH值范围下其酶活力最高，酶解原料更充分。由图4可知，蛋白回收率随着pH值的增加先增大后减少，当pH值达到7.0后缓慢减少，pH值为7.0时蛋白回收率为（65.93±1.59）%，梁蓉等[15]研究复合酶对高温花生粕的最适酶解pH值为7.0，与本结果一致。水解度在pH值为6.0～7.0之间变化不大，当pH值大于7.0时水解度呈下降趋势，pH值为7.0时水解度为（13.82±0.83）%。

由感官图可知，苦味最明显的组为pH 8.0，可能因为在碱性环境下酶解反应物呈苦味。鲜味最明显的组为pH6.5和pH 7.0，其次为pH 6.0组。综上采用pH 7.0进行下一步试验。

2.5 时间对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

时间对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图5。

图5 时间对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.5 Effects of time on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由图5可知，随着反应时间的延长，蛋白回收率和水解度都呈上升趋势，当时间达到12 h后，蛋白回收率的上升趋势较小，这与Chae等[16]研究结果一致。可能是因为酶解到了一定时间，酶活力开始减弱甚至失活，酶解效率减小。

由感官雷达图可知，鲜味分值最高的组为8 h和12 h，4 h组分值最低，可能是因为酶解不充分，鲜味物质释放量不多，20 h组则是反应时间过长，已产生明显的酸臭味，其酸度值最高，酸味掩盖了鲜味滋味。综合3个指标和时间经济效益考虑，采用酶解12 h进行下一步试验。

2.6 料液比对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

料液比对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图6。

图6 料液比对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.6 Effects of the ratio of material to liquid on the enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由图 6 可知，当料液比为 1∶6（g/mL）时，不管是蛋白回收率和水解度都远远低于其它组，这与赵龙[17]的研究结果相似，可能因为1∶6（g/mL）组的样品溶液偏浓，黏度较大，原料与酶接触不完全，导致回收率和水解度效果差。料液比从 1∶9（g/mL）到 1∶12（g/mL），蛋白回收率和水解度逐渐趋于平稳，1∶12（g/mL）之后稍有减少，潘风光等[5]研究表明当反应体系中底物比列减少，酶与原料的接触机会少，导致蛋白提取率和水解度都呈缓慢减少。

由感官评价可知，鲜味值最高的组为料液比为1∶9（g/mL）和 1∶12（g/mL），其次是 1∶15（g/mL）。其中1∶6（g/mL）酸味值最高为3。因此采用料液比为1∶12（g/mL）进行下一步试验。

2.7 温度对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响

温度对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响见图7。

由图7可知，蛋白回收率随着温度的增高呈先上升后下降的趋势，当温度为55℃时达到最高值（66.31±2.61）%，王倩等[18]认为温度过低时酶未达到最大活力，当温度过高时会导致酶活力逐渐降低，当达到一定高温时甚至失活，所以温度过高过低都不利于酶解反应的进行。水解度随着温度的升高呈下降趋势可能是因为酶活力下降，不利于水解反应

图7 温度对啤酒酵母-花生粕酶解效果的影响Fig.7 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由感官雷达图得温度为65℃时酸味明显，其中鲜味最强的组为55℃，其次为50℃。苦味值各组相差不大。综合上述分析，取55℃时为最适反应温度，蛋白回收率为（66.31±2.61）%，水解度为（19.77±0.55）%。

2.8 正交试验分析

根据单因素试验结果，以温度、时间和加酶量为因素，取风味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（质量比），料液比为 1∶12（g/mL），pH 7.0进行正交试验。因水解度过高则会产生一定苦味[10]，对感官产生一定影响，所以最终以蛋白回收率为指标进行正交试验。试验结果分析如表2。

由表2中R值可得各因素对蛋白回收率的影响程度为A>C>B，既温度>加酶量>时间。蛋白回收率的最佳提取条件为A2B2C3，既温度为55℃，时间为12 h，加酶量为1.2%，但该组不在试验范围内，则对A2B2C3进一步试验验证，试验结果表明，其蛋白提取率为（67.78±1.06）%，水解度为（20.05±0.49）%。所以温度55℃，时间12 h，加酶量1.2%为最优条件。

表2 啤酒酵母-花生粕酶解L9（34）正交试验极差分析结果Table 2L9（34）Orthogonal experiment poor analysis of enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

2.9 肽分子量分布

肽分子量分布见图8。

图8 肽分子量分布Fig.8 Molecular weight distribution of peptide

由图8可知，肽分子量主要分布在<1 000 Da范围内，占比为79.64%，证明样品酶解的比较充分，蛋白大分子被酶切成小分子肽或氨基酸。研究表明，当分子量>5 000 Da时肽分子很难进入味蕾孔口，刺激味蕾细胞，因此其对风味贡献非常小[9]。分子量在200 Da～5 000 Da的肽均具有参加美拉德反应的活性，其占比68.71%，含量可观，有利于下一步美拉德反应[19]。

2.10 氨基酸分析

游离氨基酸含量及味道特征见表3。

氨基酸的组成及含量对滋味有着重要影响。由表3可知，酶解后的游离氨基酸总量为169.98 mg/g，其中含量最高的是谷氨酸，其占比为15.45%，且谷氨酸是对鲜味滋味的主要贡献者。在各大氨基酸分类中，鲜味氨基酸主要为谷氨酸和天冬氨酸，其占比18.54%。疏水性氨基酸占比为43.42%，主要有丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。亲水性氨基酸占比为18.01%，必需氨基酸占比为38.24%，与张佳男[20]的研究结果相近。

表3 游离氨基酸含量及味道特征Table 3 Content of free amino acids and flavor characteristics

花生粕的主要限制氨基酸有Cys、Met和Lys，经啤酒酵母-花生粕酶解后的3种限制氨基酸均比前人研究[8]的单独酶解花生粕时的含量更高，这是因为花生粕和啤酒酵母结合起到了氨基酸互补作用，这为得到营养价值高的鲜味基料提供了新思路。

3 结论

研究采用不同蛋白酶酶解啤酒酵母和花生粕混合原料，确定用风味蛋白酶和胰蛋白酶双酶复配酶解。在单因素确定了料液比、pH值等条件下，进一步采用温度、时间和加酶量做正交试验优化，得到优水平组合，此条件下的蛋白回收率为（67.78±1.06）%，水解度为（20.05±0.49）%，经优化后的样品游离氨基酸中的必需氨基酸占比38.24%，较啤酒酵母和花生粕有着更高营养价值。肽分子量主要分布在1 000 Da以下，水解效果良好。所得样品鲜味独特，苦味值较低，为开发新的鲜味基料提供实践参考。