β-伴大豆球蛋白糖基化产物的致敏性研究

陈晓旭，吴玥琨，张燕*

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津 300071）

近年来，人们对于食物过敏的关注度越来越高。常见的食物过敏原包括花生、大豆、奶、蛋、鱼、贝类、坚果等，食品标识委员会将其定义为八大食物过敏原[1]。其中大豆为人们膳食提供了丰富的植物蛋白，而致敏性是它的主要劣势，阻碍其在食品加工中的应用。大豆致敏蛋白中β-伴大豆球蛋白约占大豆蛋白总量的30%[2]，是大豆主要的过敏原[3]。β-伴大豆球蛋白是由α、α′和β亚基组成的三聚体结构，每个亚基由酸性肽链和碱性肽链组成，结构非常稳定，因此β-伴大豆球蛋白的致敏性相对稳定。

目前已经报道了很多用来降低蛋白质的致敏性的食品加工方法[4-6]，包括发酵、煎炸、烘烤等，主要是通过蛋白质分子内、分子间的共价键或非共价键相互作用，导致二级或三级结构改变，从而影响蛋白质的致敏性。糖基化反应是在酶的作用下，蛋白质的氨基和还原糖的羰基之间形成糖蛋白的过程[7]。在食品加工中糖基化反应可能引起蛋白质功能特性发生改变，并对蛋白质具有一定的修饰作用，可修饰蛋白质的抗原表位，从而影响蛋白质的致敏性[8]。据报道，经糖基化反应后降低了花生过敏原的致敏性[9]。刘俊等将牛血清蛋白和α-乳白蛋白经超声波辅助糖基化处理后，发现蛋白质的结构与功能性质发生了改变，并降低了α-乳白蛋白的致敏性[10]。糖基化反应中，蛋白质的抗原表位发生了变化，从而影响蛋白质的致敏性[11]。

目前，评价糖基化修饰对过敏原的影响，主要是通过酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和蛋白质免疫印迹法检测过敏原免疫活性，但这类方法缺乏严谨性，还有待进一步完善。因此本研究选择食品加工中常用的配料葡萄糖和β-伴大豆球蛋白，通过几种典型的热加工条件，制备β-伴大豆球蛋白的糖基化修饰产物，并进行体内动物实验，探讨加热过程中葡萄糖对β-伴大豆球蛋白的糖基化修饰作用，以及对β-伴大豆球蛋白致敏性的影响，为通过食品加工方式降低蛋白致敏性奠定了一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-伴大豆球蛋白：自制；葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司；霍乱毒素（cholera toxin，CT）：美国 Sigma-Aldrich公司；组胺、免疫球蛋白（immunoglobulin E，IgE）、类胰蛋白酶试剂盒：南京建成有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Milli-Q超纯水仪：德国默克密理博公司；FE20K型PH计：瑞士梅特勒-托利多公司；5804R离心机：美国Beckman公司；MS3涡旋混合器：德国IKA公司；SB-4200D超声波清洗机：中国新芝生物科技股份有限公司；BL610电子天平：德国Sartorius公司；UF-110烘箱：上海美墨尔特贸易有限公司；Evolution 300紫外分光光度计：美国Thermo公司；SBH200D/3干浴器：英国Stuart公司。

1.3 方法

1.3.1 β-伴大豆球蛋白的制备

参考文献[12]中方法对β-伴大豆球蛋白进行分离及提纯。

1.3.2 β-伴大豆球蛋白糖基化产物的制备

将50 mg纯度为92.46%的β-伴大豆球蛋白加入10 mL磷酸盐缓冲溶液，葡萄糖与β-伴大豆球蛋白的质量比为4∶1，反应的条件分别为低温糖基化：70℃加热8 h；蒸煮糖基化：100℃加热30 min；高压灭菌糖基化：121℃加热15 min。所有条件下反应后的糖基化产物需透析处理除掉游离糖等小分子。

1.3.3 免疫方法

雌性、4周龄、质量在（20±5）g的BALB/c小鼠，饲养在温度（25.5±2）℃和湿度70%的条件下。将50只小鼠，随机分为5组，每组10只。第1周小鼠正常饮食，第2周开始，灌胃小鼠300 μL生理盐水（空白组，n=10）、灌胃小鼠 300 μL β-伴大豆球蛋白（1 mg/mL）和霍乱毒素（CT）（0.01 mg/mL）混合液（过敏组，n=10）、灌胃小鼠300 μL低温糖基化产物（1 mg/mL）和CT（0.01 mg/mL）混合液（低温糖基化组，n=10）、灌胃小鼠300 μL 蒸煮糖基化产物（1 mg/mL）和 CT（0.01 mg/mL）混合液（蒸煮糖基化组，n=10）和灌胃小鼠300 μL高压灭菌糖基化产物（1 mg/mL）和 CT（0.01 mg/mL）混合液（高压灭菌糖基化组，n=10），以上灌胃的所有混合液溶剂均为生理盐水。每周灌胃1次，第5次激发，观察过敏症状后，处死，取血清-80℃保存待测。

1.3.4 过敏症状评分

每组小鼠激发后30 min～50 min，仔细观察小鼠的行为及体貌特征并依照表1中表述的内容进行评价[13]。

表1 小鼠过敏症状评分标准Table 1 Scoring standard for allergic mouse symptoms

1.3.5 血清中组胺含量的测定

采用组胺含量测定试剂盒进行测定。

1.3.6 血清中免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）含量的测定

采用IgE含量测定试剂盒试剂盒进行测定。

1.3.7 血清中类胰蛋白酶含量的测定

采用类胰蛋白酶含量测定试剂盒进行测定。

1.3.8 糖基化产物接枝度的测定

参照文献[14]中的方法测定β-伴大豆球蛋白糖基化产物的接枝度。将2 mg/mL 200 μL β-伴大豆球蛋白糖基化产物溶液（溶剂为pH 7.4的磷酸盐缓冲液）加入4 mL邻苯二甲醛试剂，并在35℃下水浴2 min，用紫外分光光度计分别测其在340 nm处的吸光值。空白管里分别加入4 mL邻苯二甲醛和200 μL磷酸盐缓冲液。

接枝度（grafting degree，DG）计算公式如下。

式中：At为接枝物溶液的吸光值；A0为单一蛋白溶液在同一反应条件下的吸光值。

1.3.9 糖基化产物内源荧光性的测定

参照文献[15]中的方法测定糖基化产物内源荧光性。用磷酸盐缓冲液溶解，配制成浓度为0.2 mg/mL的β-伴大豆球蛋白溶液。荧光仪参数设置激发波长为295 nm，扫描速度为60 nm/min。最终测定β-伴大豆球蛋白的荧光发射光谱范围在300 nm～400 nm。

1.3.10 糖基化产物二级结构的测定

分别准确的称取2mg的β-伴大豆球蛋白和150mg的溴化钾，充分的研磨，再将研磨后的混合粉均匀的放于压片机中，进行红外光谱扫描。以溴化钾作为空白样，充分研磨后放置压片机中，再进行红外光谱扫描。红外光谱分别进行背景扫描和样品扫描，参数设置扫描的波段为4 000 cm-1～1 000 cm-1、分辨率为4 cm-1。采用OMNIC 8.0软件对数据进行处理。

1.4 统计与分析

每组试验至少3次重复，本试验所有数据通过软件SPSS 14.0中单因素ANOVA检验和Duncan test进行分析，结果以平均值±标准偏差（mean±SD）表示，p<0.05表示有显著差异，所用作图软件为Origin 9。

2 结果与分析

2.1 过敏症状评分

不同糖基化条件对小鼠过敏症状的影响，见图1。

图1 小鼠过敏症状评分Fig.1 Mouse allergy symptom score

如图1所示，与空白组相比，过敏组的小鼠过敏症状评分极显著升高；与过敏组相比，蒸煮糖基化组过敏症状评分显著降低；与低温糖基化组相比，高压灭菌糖基化组过敏症状评分差异不显著。空白组小鼠无异常现象；过敏组小鼠出现了严重的口唇肿胀、毛发竖立、运动活力下降等症状；低温糖基化组中有部分小鼠出现运动活力下降、毛发竖立、抓挠面部等症状；灌胃蒸煮糖基化产物和高压灭菌糖基化产物小鼠过敏反应症状不明显，说明过敏反应较弱。

2.2 体重分析

不同糖基化条件对小鼠体重的影响，见图2。

图2 小鼠体重的测定Fig.2 Determination of mouse body weight

由图2可知，与空白组相比，过敏组小鼠体重极显著降低。与低温糖基化组和蒸煮糖基化组相比，灌胃高压灭菌糖基化产物的小鼠体重差异不显著。可能是因为灌胃不同加工条件下糖基化产物的小鼠发生了不同程度的过敏反应，导致小鼠体重不同程度的降低[16]。结果表明，高压灭菌糖基化组中的小鼠体重降低程度最小，过敏反应程度最弱。

2.3 组胺含量分析

不同糖基化条件对小鼠血清中组胺含量的影响，见图3。

图3 小鼠血清中组胺含量测定Fig.3 Determination of histamine in mouse serum

如图3所示，小鼠血清中组胺水平过敏组和低温糖基化组相比，过敏组小鼠组胺含量显著升高。与低温糖基化组相比，蒸煮糖基化组和高压灭菌糖基化组中的小鼠组胺含量差异不显著。不同条件下的糖基化组中小鼠的组胺含量出现不同程度的降低可能是因为肥大细胞脱颗粒作用降低，因此减少了组胺的释放[17]。结果表明，高压灭菌糖基化组中小鼠的组胺含量最低，导致过敏反应程度最弱。

2.4 IgE含量分析

不同糖基化条件对小鼠血清中IgE含量的影响，见图4。

图4 小鼠血清中IgE含量测定Fig.4 Determination of IgE in mouse serum

如图4所示，与空白组相比，过敏组小鼠IgE含量极显著升高。与低温糖基化组相比，蒸煮糖基化组和高压灭菌糖基化组的小鼠IgE含量差异不显著。IgE含量是衡量过敏反应程度的重要指标[18]。结果表明，灌胃高压灭菌糖基化产物的小鼠血清中IgE含量最低，导致小鼠的过敏反应程度最弱。

2.5 类胰蛋白酶含量的分析

不同糖基化条件对小鼠血清中类胰蛋白酶含量的影响见图5。

图5 小鼠血清中类胰蛋白酶含量测定Fig.5 Determination of tryptase content in mouse serum

如图5所示，与空白组相比，过敏组小鼠的类胰蛋白酶含量极显著升高。与过敏组相比，各糖基化组小鼠的血清中类胰蛋白酶含量均有不同程度的降低。与低温糖基化组相比，灌胃高压灭菌糖基化产物小鼠的类胰蛋白酶含量差异显著。因为类胰蛋白酶含量是过敏患者血清中检测的重要指标，可以一定程度上反应过敏的程度[19]，结果表明高压灭菌组的小鼠类胰蛋白酶含量最低，过敏反应程度最弱。

2.6 糖基化产物接枝度的分析

不同条件下的糖基化产物对接枝度的影响，见图6。

图6 糖基化产物接枝度测定Fig.6 Determination of the degree of grafting of glycosylation products

从图6中可看出，β-伴大豆球蛋白与葡萄糖在低温、蒸煮和高压灭菌条件处理后的接枝度分别为10.46%、15.06%和35.17%。与低温糖基化组相比，高压灭菌糖基化组的接枝度极显著升高。结果表明，随着加工温度的升高接枝度也呈显著升高的趋势，原因可能是β-伴大豆球蛋白是三聚糖蛋白，反应温度越高，导致分子结构越容易发生改变[14]。由此表明，高压灭菌糖基化产物的接枝度最高，从而导致蛋白致敏性最弱。

2.7 糖基化产物内源荧光性的分析

蛋白质的内源荧光性是通过测定生物大分子的荧光发色团，从而获得生物大分子的结构、功能等信息。蛋白质分子中能发射荧光的氨基酸主要有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[20]。因此，通过内源荧光光谱测定蛋白质荧光强度，可以判断蛋白质的结构是否发生改变。不同条件下的糖基化产物对荧光强度的影响，见图7。

图7 糖基化产物内源荧光性的测定Fig.7 Determination of endogenous fluorescence of glycosylation products

从图7可以看出，与低温糖基化产物比较，蒸煮糖基化和高压灭菌糖基化产物的荧光强度明显降低。原因可能有以下几种：1）热处理后蛋白质的结构发生了变化，色氨酸残基埋藏到疏水的环境中[21]；2）葡萄糖侧链的蛋白质结构对色氨酸残基具有屏蔽作用[22]；3）色氨酸发生荧光淬灭[23]；4）因为反应温度太高，蛋白质分子迅速展开聚集，色氨酸残基大量损失[24]，导致荧光强度下降。结果说明，高压灭菌糖基化产物荧光强度最低，导致蛋白致敏性最弱。

2.8 糖基化产物二级结构的分析

蛋白质的二级结构是肽链中有规则的重复的构象，主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲[25]。不同条件下的糖基化产物对二级结构的影响见表2。

从表2可以发现，与蒸煮糖基化和高压灭菌糖基化产物相比，低温糖基化产物α-螺旋含量显著降低。与低温糖基化和蒸煮糖基化产物相比，高压灭菌糖基化产物二级结构中β-折叠和β-转角的含量显著降低，无规则卷曲的含量显著增加。随着反应温度的升高，蛋白质中有序结构转变成无序结构。在糖基化反应中蛋白质与糖之间以共价键聚集，其中α-螺旋、β-折叠、β-转角等通常情况下存在于肽链的内部，热处理后可能会导致二级结构发生改变[26]。结果表明，高压灭菌糖基化产物二级结构中β-折叠、β-转角含量最低和无规则卷曲含量最高，导致蛋白致敏性最弱。

表2 糖基化产物二级结构的测定Table 2 Determination of the secondary structure of glycosylation products

3 结论

通过评估典型过敏指标以及糖基化产物结构，发现与低温糖基化产物和蒸煮糖基化产物相比，高压灭菌糖基化产物的结构变化最显著，导致蛋白致敏性最弱。本研究评价了不同加工条件下β-伴大豆球蛋白糖基化产物的致敏性，为有效降低食品热加工中大豆制品的致敏性提供重要的参考。