3种酿酒葡萄花色苷及其稳定性研究

于聪，李艳，2*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

花色苷（anthocyanin）是葡萄果皮中的主要呈色物质，属于类黄酮化合物，表现为蔬菜和水果的红色、紫色和蓝色等鲜艳的色彩[1]。酿酒葡萄中的花色苷是以C6-C3-C6为基本骨架，以糖苷键与糖结合而成的一类黄酮多酚类化合物[2-3]，2-苯基苯并吡喃阳离子的多羟基或多甲氧基衍生物，含有2个被含氧杂环（C）分开的苯甲酰环（A、B），花色苷母核结构见图1。花色苷结构上的R1、R2基团有6种组合，可形成具体的花色苷[4-5]，见表 1。

表1 最常见的花色苷Table 1 The most common anthocyanins

图1 花色苷母核结构Fig.1 Anthocyanin parent nucleus structure

花色苷3、5、7位上的羟基常通过糖苷键与糖结合，因糖的种类（葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等）、数量（单糖、二糖、三糖等）、位置（3-单糖苷、5-双糖苷、3，5-二糖苷等）及结合于糖残基上芳香酸或脂肪酸的数目和性质等不同，会衍生出多种花色苷类化合物[6]。

酿酒葡萄的花色苷稳定性较差，温度、SO2浓度、光照和pH值等因素均可影响其结构和组成改变，相应的生物活性也将随之改变。适宜浓度的SO2处理对花色苷有保护作用，可减缓花色苷的褪色[8-9]。本文研究美乐、赤霞珠、马瑟兰3种酿酒葡萄的花色苷种类及稳定性，为酿造优质红葡萄酒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美乐、赤霞珠、马瑟兰：中粮华夏长城葡萄酒有限公司；矢车菊素-3-葡萄糖苷（色谱级）：上海宝曼生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色谱级）：美国fisher有限公司；甲酸（分析纯）：天津永大化学试剂公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；盐酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；95%乙醇（分析纯）：新宇三阳实业有限公司。

1.2 仪器与设备

试验仪器与设备见表2。

表2 试验仪器与设备Table 2 Experimental instruments and equipment

1.3 试验方法

1.3.1 花色苷溶液的制备

新鲜葡萄（或冷冻葡萄解冻）→打浆→乙醇提取[葡萄浆 ∶60%乙醇溶液=1∶18（g/mL），50℃浸提3 h]→50℃旋转蒸发回收乙醇→花色苷粗提液→避光保存

1.3.2 花色苷粉末的制备工艺

花色苷粗提液→真空冷冻干燥（冷阱温度-80℃，干燥24h）→花色苷冻干粉→密封于2mL试管→-20℃保存

1.3.3 总花色苷含量的测定

采用pH示差法[10-12]，吸取果汁1mL，分别加入12mL pH 1.0的缓冲溶液、12 mL pH 4.5的缓冲溶液，避光放置15 min，在520 nm和700 nm波长处测定吸光度。根据以下公式计算总花色苷含量。

式中：X 为总花色苷含量，mg/L；A 为（A20-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；M为3-葡萄糖苷-矢车菊素的摩尔质量，449.2 g/mol；ε为摩尔消光系数，26900 L/（mol·cm）。

1.3.4 花色苷种类和含量的测定

超高压液相色谱-三重四极杆质谱联用仪检测3种葡萄样品60%乙醇提取后的花色苷溶液中的花色苷种类和含量。

质谱检测（mass-spectrometric detection，MSD）参数为ESI离子源，负离子模式（花色苷正离子模式）；扫描模式：全自动二级质谱扫描；雾化器压力：15 psi（1 psi=6.895 kPa）；干燥气流速：10 L/min；干燥气温度：350 ℃；离子扫描范围（m/z）：100～1 000。分离柱为Agilent C18，2.1×50 mm，1.8μm，柱温45℃，进样量 3 μL。流动相B为0.1%甲酸水溶液，D为乙腈，流速0.3 mL/min。洗脱程序见表3。

表3 花色苷洗脱程序Table 3 Anthocyanin elution procedure

1.3.5 花色苷的稳定性测定

1.3.5.1 pH值对花色苷稳定性的影响

参考江澜[13]、李雨浩等[14]的方法，稍作修改。准确称取美乐、赤霞珠、马瑟兰3种酿酒葡萄花色苷冻干粉5 mg于5 mL水中，制成1 mg/mL的花色苷水溶液，用0.05 mol/L NaOH和0.2 mol/L HCl调花色苷水溶液的pH 值为 2、3、4、5、6、7，摇匀，室温（25 ℃）避光放置2 h，观察不同pH值下溶液的颜色变化，同时用色彩色差计测定溶液的亮度（lightness，L）、色度（chroma，C）、总色差（total color difference，TCD）值[15]，试验设 3个平行。

1.3.5.2 温度对花色苷稳定性的影响

参考赵慧[16]的方法，稍作修改。将花色苷水溶液分别置于 4、25、55、75、100 ℃环境，保鲜膜封口加热 3 h，每隔1 h测定一次，取样时迅速冷却至室温（25℃），用色彩色差计测定不同温度下花色苷溶液的L、C、TCD值。

1.3.5.3 光照对花色苷稳定性的影响

参照刘芳芳等[17]的方法，稍作修改。将pH值2～4的花色苷水溶液置于白色玻璃瓶内，保鲜膜封口，分别放置于避光、日光灯加自然光（统称为自然光）、室温（25℃）超净台紫外灯下，观察7 d，每天固定时间用色彩色差计测定不同光处理下花色苷溶液的L、C、TCD值。

1.3.5.4 SO2添加量对花色苷稳定性的影响

参照张珍珍等[18]的方法，稍作修改。将50 g/L的SO2溶液，按照浓度为 30、40、50、60、70（mg/L），分别加入到美乐、赤霞珠、马瑟兰葡萄的花色苷水溶液中，混匀避光静置24 h，用色彩色差计测定花色苷溶液的L、C、TCD值。

1.4 数据处理

所有试验均重复操作3次。重复性和准确性试验的数据均由Excel 2010计算得出，Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 3种酿酒葡萄的总花色苷含量

3种酿酒葡萄的花色苷含量见表4。

表4 美乐、赤霞珠、马瑟兰的总花色苷含量Table 4 Anthocyanin content of Merlot，Cabernet Sauvignon and Marselan

由表4可知，挤汁未经醇提的酿酒葡萄花色苷含量为赤霞珠＞马瑟兰＞美乐，与醇提相比花色苷含量偏低，说明有大量花色苷仍残留在葡萄皮中。醇提后3种酿酒葡萄花色苷的含量为马瑟兰＞赤霞珠＞美乐，说明酿酒葡萄果皮中花色苷的溶解性不同。

2.2 3种酿酒葡萄的不同花色苷种类及含量

3种酿酒葡萄的不同花色苷种类及含量测定结果见表5。

表5 美乐、赤霞珠、马瑟兰3种酿酒葡萄的花色苷种类Table 5 Anthocyanin species of Merlot，Cabernet Sauvignon and Marselan three wine grapes

花色苷是葡萄果皮中呈色的主要物质[19-21]，主要存在于紫色或红色葡萄的果皮中。由表5可知，3种酿酒葡萄分别检测到11、12、11种花色苷物质，共同含有8种花色苷类物质；赤霞珠和马瑟兰葡萄均未检测到花葵素-3-芸香糖苷，美乐和马瑟兰葡萄均未检测出花葵素-3-半乳糖苷，甲基花青素-3-阿拉伯糖苷仅在美乐中未检测出；在检出的花色苷中，3′，5′-二甲花翠素葡萄糖苷含量占总花色苷含量的50%以上，而且二甲花翠素类所占比例最高[22]，花青素类所占比例最低；3种酿酒葡萄以花翠素、二甲花翠素、甲基花青素为主要花色苷。一些研究者认为花青素是其他花色苷合成的前体物质[23]，3种酿酒葡萄的花色苷含量依次是赤霞珠＞马瑟兰＞美乐，这与杨晓慧等[19]、ANA 等[24]、张娟等[25]的报道一致。

2.3 3种酿酒葡萄花色苷的稳定性

2.3.1 pH值对3种葡萄花色苷稳定性的影响

pH值影响花色苷结构的改变，pH值≤3时，花色苷以红色吡喃阳离子结构存在，结构稳定；花色苷结构在pH 4～5时是不稳定的，化学结构很容易改变。pH值对花色苷稳定性的影响见图2。

图2 pH值对3种酿酒葡萄的花色苷稳定性影响Fig.2 Effect of pH on anthocyanin stability of three kinds of wine grapes

如图2所示，pH值对3种酿酒葡萄花色苷的稳定性影响很大，甚至改变了花色苷的化学结构。花色苷溶液色泽越深，亮度（L）越小，色度（C）越大，总色差（TCD）越大。图2中3种葡萄的L值随pH值的提高先增加后下降，C值随pH值的增加而下降，TCD值随pH值的增加而增加。当pH值≤3时，3种酿酒葡萄花色苷的L值呈上升趋势，C值呈下降趋势，TCD值的增加幅度高于pH值≥4的增加幅度。pH值>5后，花色苷的L值逐渐下降。因此，花色苷在较低pH值下是稳定的，在较高的pH值条件下是不稳定的。这与文献[26]研究的结果一致。

2.3.2 光照对3种葡萄花色苷稳定性的影响

光照对花色苷有一定的降解效果，长时间的光照会造成花色苷的大量损失，而且不同的光照处理对于花色苷的影响也不同。光照对3种葡萄花色苷稳定性的影响见图3。

图3 光照处理对3种酿酒葡萄花色苷稳定性的影响Fig.3 Effect of light treatment on stability of anthocyanins in three wine grapes

由图3可知，随光处理时间的延长，L值、C值呈下降趋势，TCD值呈现上升趋势。光处理第3天，花色苷溶液出现明显的褪色现象，自然光和紫外线处理的花色苷溶液先出现白色和其他絮状物；光处理第5天后，花色苷溶液明显变浅，说明花色苷在长时间光照处理下是极其不稳定的。

采用3种光处理赤霞珠、美乐、马瑟兰酿酒葡萄花色苷，马瑟兰葡萄的花色苷稳定性强于美乐，赤霞珠葡萄稳定性相对较弱。避光处理3种葡萄花色苷的L值下降速度低于紫外光和自然光。相同时间内，避光处理的花色苷含量高于紫外和自然光的花色苷含量，避光花色苷的TCD值高于紫外光和自然光。可能是因为花色苷在光照条件下酰基脱落，导致稳定性下降。长时间的光照处理会影响花色苷，时间越长，花色苷降解越多，花色苷含量越低，溶液颜色越浅，这说明紫外光照和自然光照对花色苷有强降解作用，这与Azuma等[27]的研究结论相似。

综上所述，由图3可知，马瑟兰葡萄花色苷稳定性高于赤霞珠和美乐，避光环境比光照环境更利于花色苷水溶液的稳定。

2.3.3 储藏温度对花色苷稳定性的影响结果

花色苷的热降解规律符合第一热力学公式，在加热时间延长、温度升高的情况下花色苷的降解速率也随之加快。储藏温度对花色苷稳定性的影响见图4。

由图4可知，随着储藏温度的升高，葡萄花色苷的L值和TCD值上升，C值下降，颜色变浅。在4℃和25℃的较低温度下，3种酿酒葡萄花色苷溶液的L值、C值、TCD值基本无变化；50℃时，发生略微变化；而在75℃时，相对于较低温度都发生显著性变化。可见温度提高，影响葡萄花色苷溶液的稳定性。75℃以下，花色苷具有较强的热稳定性，随温度升高，耐热性逐渐降低，这是由于在高温下花色苷易氧化褪色[28]，还可能是因为温度升高导致部分色素复合物的解离，从而产生无色化合物，导致颜色丧失。较高的温度可能会使花色苷的结构发生变化，花色苷上的基团和单体会发生位移[15，29]。因此，储藏温度需不超过50℃。

图4 储藏温度对3种酿酒葡萄花色苷稳定性的影响Fig.4 Effect of storage temperature on stability of three wine grapes anthocyanins

2.3.4 SO2浓度对酿酒葡萄花色苷稳定性的影响

当还原剂浓度较大时可严重破坏花色苷结构。SO2还原性强，SO2在常温下就能表现出强氧化性，破坏花色苷的化学结构，使花色苷褪色。SO2浓度对酿酒葡萄花色苷稳定性的影响见图5。

由图5可知，马瑟兰葡萄的花色苷稳定性强于美乐和赤霞珠。随SO2浓度增加，花色苷溶液的L值逐渐增加，C值和TCD值逐渐下降。高浓度SO2对花色苷的稳定性有一定的破坏作用；且当SO2浓度升高时，花色苷与硫酸氢根离子发生缩合反应使葡萄颜色衰退。并且由于SO2具有强还原性，因此氧化脱色的能力也随之而来。SO2浓度≤40 mg/L时，3种酿酒葡萄的花色苷溶液颜色基本上保持红色，无变化。SO2浓度过低，则抑制和杀菌能力不能发挥，因此建议SO2浓度≤40 mg/L比较合适。

图5 SO2浓度对3种葡萄花色苷稳定性的影响Fig.5 The effect of SO2concentration on the stability of anthocyanins in three wine grapes

3 结论

花色苷是酿酒葡萄和所酿酒的重要功能指标，其自身结构和性质的稳定无疑直接影响着产品的感官、营养、安全性和功能性。本文通过超高压液相色谱质谱联用仪测定了赤霞珠、美乐和马瑟兰3种酿酒葡萄花色苷的种类及含量，其共同含有8种花色苷，赤霞珠含花色苷种类最多为12种，美乐和马瑟兰含花色苷种类为11种；3′，5′-二甲花翠素葡萄糖苷含量占绝对优势，3种酿酒葡萄均以花翠素、二甲花翠素、甲基花青素为主，含量依次为：赤霞珠>马瑟兰>美乐。温度、SO2浓度、光照和pH值等因素影响花色苷稳定性，其结构和组成会发生改变，相应的生物活性也将随之改变。适宜浓度的SO2对花色苷有保护作用，可减缓褪色。维持pH值≤3和SO2浓度≤40 mg/L，且在温度低于50℃下避光保存，花色苷较稳定，C6-C3-C6结构不易发生变化。