响应面法优化南极磷虾油微胶囊喷雾干燥制备工艺的研究

苗钧魁，魏书磊，刘小芳，于 源，张笑梅，冷凯良,

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部极地渔业开发重点实验室，山东青岛 266071；2.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋药物与生物制品功能实验室，山东青岛 266200；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266100）

南极磷虾油是从南极磷虾中提取的具有保健疗效的油脂。研究认为，南极磷虾油富含ω-3、ω-6 类多不饱和脂肪酸以及虾青素等活性物质[1]，除了具备预防炎性反应疾病、心脑血管疾病、老年痴呆症、糖尿病等重大疾病的功效[2−6]，在体内还可以起到清除自由基、修复DNA 损伤、抗炎活性、改善认知能力等作用[5,7−10]。另外，虾青素作为一种抗氧化能力极强的内源性抗氧化剂，对防止油脂氧化变质也起到一定作用[11]。

目前，在开发利用南极磷虾油方面还存在诸多问题，表现为产品以软胶囊为主，剂型单一；易变质，储存条件要求高；磷脂含量高，易乳化，应用范围受限制[1,12]。运用微胶囊技术，将南极磷虾油包在毫米至微米大小的胶囊中，可以隔绝与外界的接触，延长产品的贮藏时间，提高产品的溶解度，保护活性成分不被破坏[13]。针对油性内容物的微胶囊化方法主要有：喷雾干燥法[14]、复凝聚法[15]、真空冷冻干燥法等。本研究采用的喷雾干燥法是将芯材分散在壁材溶液中，在高温气流中将芯材、壁材的混合溶液雾化，使溶液中的溶剂迅速蒸发，最终使壁材固化而得到微胶囊产品[16]。较其他方法，喷雾干燥法具有操作简便，成本较低的优点，微胶囊化产品颗粒大小均匀，产品质量好，易于实现规模化生产，是微胶囊技术中应用最为广泛的方法[17]。暴莎莎[18]利用麦芽糊精和明胶为壁材，喷雾干燥法制备了表面较光滑、无褶皱的南极磷虾油微胶囊，包埋率达到74.15%。赵鑫鹏等[19]以海藻酸钠与壳聚糖为壁材，采用锐孔法制备南极磷虾油微胶囊，包埋率达到86.45%。戴妍等[20]比较了不同壁材生产蛋黄卵磷脂微胶囊的包埋率和性能等指标，说明壁材的选择对微胶囊性能优劣具有关键作用。包埋率是影响微胶囊品质的主要指标。包埋率低，附着在微胶囊表面的油脂多，微胶囊极易氧化变质，储存难度大，生产成本高，无法进入商业化生产。本文使用酪蛋白酸钠、明胶、麦芽糊精作为壁材，制备南极磷虾油微胶囊，在单因素基础上，以包埋率为响应值，采用响应面法优化了南极磷虾油微胶囊的配方工艺，并探索了微胶囊的理化性质，为南极磷虾油工业化生产提供了工艺支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾油 食品级，南极维康有限公司；明胶 食品级，山东恒源康生物科技有限公司；酪蛋白酸钠 分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；麦芽糊精、正己烷、乙石油醚 分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

BILON-6000Y 实验室小型喷雾干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；JZH50-80 高压均质机 上海锦竹机械设备有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器 郑州科泰实验设备有限公司；BAS224S-CW 电子分析天平 德国赛多利斯科学仪器有限公司；Zs90 激光粒度分析仪 英国Malvern Zatasizer Nano 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南极磷虾油微胶囊的制备 称取一定质量的酪蛋白酸钠、明胶、麦芽糊精分别溶解，酪蛋白酸钠直接溶解到70℃蒸馏水中，浓度约为6%，明胶经少量水溶胀后加入到酪蛋白酸钠溶液中，麦芽糊精直接加入到酪蛋白酸钠溶液中，用磁力搅拌器搅拌直至充分混合，冷却至50 ℃，得到壁材溶液；取一定质量的南极磷虾油，水浴加热至50 ℃左右，边搅拌边加入到壁材溶液中，磁力搅拌器充分搅拌，经高压均质机均质后得到乳化液，均质压力设定为35 MPa，均质3 次。将此乳化液通过喷雾干燥机喷雾干燥得到南极磷虾油微胶囊，进风温度设定为200 ℃，进料量为20 mL/min。

工艺流程：

配料（水、壁材、南极磷虾油）→乳化→高压均质→喷雾干燥→微胶囊

1.2.2 检测方法 包埋率计算公式：

测定产品表面油：首先，准确称取适量的微胶囊产品，记作M，用一定体积的正己烷浸提大约2 min后，过滤，再用2 倍体积正己烷进一步浸提，过滤，收集两次滤液，放入旋蒸瓶进行旋蒸，直到正己烷完全出去为止，其质量记做m。

表面油计算公式：

测定产品总油：参考GB 5009.6-2016 中脂肪的测定方法，略有改动。将分液漏斗放置于架子上，向分液漏斗内加入1～2 g 南极磷虾油微囊和10 mL 60 ℃热水，振摇破壁，肉眼观察不能有大颗粒，先后加入10 mL 无水乙醇、50 mL 石油醚，充分振摇，静置30 min 直到清晰分层，用吸管吸取上层液体，转移至旋蒸瓶内，浓缩得到总油。

1.2.3 单因素实验 选取各因素条件梯度：酪蛋白酸钠用量16%、20%、24%、28%、32%，明胶用量4%，芯壁质量比1:3；明胶用量2%、4%、6%、8%、10%，酪蛋白酸钠20%，芯壁质量比1:3；芯壁质量比：1:1.5、1:2、1:3、1:4，酪蛋白酸钠24%，明胶6%。固形物（芯材和壁材总和）浓度25%，不足浓度以麦芽糊精填充。

1.2.4 响应面试验设计 综合单因素实验结果确定显著因素和最佳条件，对明胶 A、酪蛋白酸钠 B、芯壁质量比C 设计了三因素三水平响应面优化试验。以 A、B、C 为自变量，以南极磷虾油微胶囊包埋率为响应值，采用 Design-Expert10.0 进行响应面中心组合设计，实验因素及水平设计见表1 。

表1 因素及水平表Table 1 Factors and levels table

1.2.5 南极磷虾油微胶囊理化性质的测定

1.2.5.1 水分含量的测定 按照食品安全国家标准GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》中直接干燥法测定。

1.2.5.2 灰分的测定 参照食品安全国家标准GB 5009.4-2016 中的高温灼烧法测定。称取5 g 左右微胶囊，加入1.00 mL 乙酸镁溶液（240 g/L）使试样完全润湿。放置10 min 后，在水浴上将水分蒸干，在电热板上以小火加热使试样充分炭化至无烟，然后置于高温炉中，在550±25 ℃灼烧4 h。冷却至200 ℃左右，取出，放入干燥器中冷却30 min，称量。重复灼烧至前后两次称量相差不超过0.5 mg 为恒重。

1.2.5.3 吸湿性的测定 首先，在表面皿中放入10～20 g 的样品，放置于干燥器中，脱湿12 h 以上；然后，将表面皿置于药品稳定性试验箱内，设置湿度75%，温度25 ℃，每隔1 h 取出表面皿，精密称量1 次，放回试验箱，平行测定3 次；最后，根据记录数据计算吸湿增重并绘制样品12 h 吸湿曲线。

1.2.5.4 粒径的测定 取少量微胶囊粉末溶于烧杯中，待全部溶解后，取适量置于玻璃皿中，用Zs90 激光粒度分析仪测定微胶囊平均粒径大小。

1.2.6 南极磷虾油微胶囊机械强度 参照文献[21]报道方法，利用离心法研究南极磷虾油微胶囊在不同pH 环境中的机械强度。取一定量的微胶囊，于3 支离心管中，加入一定体积的超纯水，混匀，使其充分分散，然后用0.1 mol/L 的盐酸或氢氧化钠分别调PH 至3.0、4.0、7.0，于1000 r/min 下分别离心15、30、45、60 min。控制在4 ℃，尽可能的减少溶剂的挥发和油酯降解。离心后，向体系中加入一定体积的正己烷，50 r/min 涡旋3 min，静置10 min，收集正己烷相，旋蒸除去正己烷即得到释放油脂，以离心前样品作为对照，分析南极磷虾油的释放情况。

计算离心过程中由于离心作用力释放出的南极磷虾油占样品中总南极磷虾油酯的百分含量定义为释放率，按照下式（3）进行计算：

式中：m0表示体系中南极磷虾油的总量，mg；mt表示离心时间为t 时，体系中释放出的南极磷虾油总量，mg；m0表示未被包埋的南极磷虾油，即离心前（0 min）样品中释放出的南极磷虾油，mg。

1.3 数据处理

重复所有实验至少3 次，结果表示为平均值±标准差（SD）。采用Excel2010 和Origin2018 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酪蛋白酸钠对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响 图1 显示了明胶用量4%时，同等梯度酪蛋白酸钠用量，酪蛋白酸钠以及酪蛋白酸钠和明胶共同作为壁材时（均添加适量麦芽糊精），南极磷虾油微胶囊包埋率的差异。从图1 可以看出添加明胶后南极磷虾油微胶囊包埋率明显提高。因此，选用酪蛋白酸钠和明胶作为南极磷虾油微胶囊的壁材。从图1 中酪蛋白酸钠和明胶共同作为壁材时微胶囊包埋率的曲线可以看出，包埋率随着酪蛋白酸钠用量的增加先上升后下降，在酪蛋白酸钠用量为24%时达到最高值90.2%±0.34%。因此，酪蛋白酸钠的用量24%为宜。

图1 添加明胶和不添加明胶两种情况下南极磷虾油微胶囊包埋率的差异Fig.1 Differences in the embedding rate of Antarctic krill oil under single and composite wall materials

2.1.2 明胶用量对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响 明胶用量对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响，如图2 所示，明胶用量由2%增加到4%时，微胶囊的包埋率迅速上升，在4%时达到最大值92.6%±0.34%，而后出现下降趋势。因此，明胶的用量以4%为宜。

图2 明胶对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响Fig.2 Effect of gelatin on embedding rate

2.1.3 芯壁质量比对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响 由图3 可知，随着芯材与壁材质量比的降低，南极磷虾油包埋率增加，当芯材与壁材的比例提高到1:3 时，达到91.6%±0.45%。芯材载量过高时，生产成本低，但是微胶囊囊壁厚度过低，渗透性高，南极磷虾油的包埋率低，稳定性差；降低芯壁质量比，可以增加微胶囊壁厚度，降低微胶囊的渗透性，防止芯材流失或受氧气、水蒸气等外在因素的影响，延长微胶囊的货架期，但是生产成本增加。所以，综合考虑微胶囊性能和生产成本，选择芯壁质量比为1:3 作为制备南极磷虾油微胶囊的最佳工艺条件。

图3 芯壁质量比对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响Fig.3 Effect of the core-wall mass ratio on embedding rate

2.2 响应面法优化分析

响应面分析方案及实验结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken 中心组合实验设计及实验结果Table 2 Design and experimental results of Box-Behnken central composite

由表3 可知，模型的决定系数R2=0.9988，表示模型的相关度非常好，模型调整系数R2=0.9973，表明模型能解释99.73%的响应值变化，模型失拟项P=0.1515>0.05，表明模型显著性较好，因此可以根据该数学模型，预测和分析南极磷虾油微胶囊制备工艺中不同的配料比下微胶囊的包埋率，辅助设计新的配方工艺。拟合回归方程：包埋率（%）=92.63+1.43625A+0.9375B−1.95625C−0.3425AB−0.585AC+0.2525BC−5.6825A2−5.12B2−2.8225C2。其中，A、B、C、A2、B2和C2项均是影响极显著的因素（P<0.01），AB 项为影响显著的因素（P<0.05），对南极磷虾油微胶囊包埋率影响大小顺序依次为：芯壁比>明胶>酪蛋白酸钠。BC 交互作用不显著，AB、AC 的交互作用显著，表明各个影响因素与响应值之间不是简单的线性关系，图4、图5、图6 更直观描述了3 因子对响应值的影响。

表3 回归模型的方差分析及显著性检验Table 3 Analysis of variance and significance test of regression model

图4 明胶和酪蛋白酸钠交互影响的响应面图Fig.4 Response surface diagram of interaction between gelatin and sodium caseinate

图5 酪蛋白酸钠和芯壁质量比交互影响的响应面图Fig.5 Response surface diagram of interaction between sodium caseinate and the core-wall mass ratio

图6 明胶和芯壁质量比交互影响的响应面图Fig.6 Response surface diagram of interaction between gelatin and the core-wall mass ratio

2.3 验证试验

为验证模型的可靠性，选用优化的参数，酪蛋白酸钠用量24.55%、明胶用量4.86%、芯壁比0.33、麦芽糊精用量45.60%，进行3 次平行实验，得到南极磷虾油微胶囊包埋率为93.79%±0.12%，与理论预测值92.65%比较，误差在3%以内，说明模型准确可靠。

2.4 南极磷虾油微胶囊的理化性质

南极磷虾油微胶囊产品呈粉末状，水分含量越低，越有利于防止产品结块或霉变。如果产品吸湿性高，在储存过程中容易引起粉末吸潮导致结块，流动性降低，颜色变深，易滋生微生物，影响产品的应用和储存性能。在该实验条下制得的南极磷虾油微胶囊产品水分含量2.31%±0.11%，置于75%的高湿度环境下12 h，在初始的2～3 h，微胶囊增重明显，随着时间的推移，增加的重量逐渐减小，在7.5 h 后增加幅度变缓（图7）。这说明微胶囊具有较强的吸湿能力，需要在干燥密封的条件下贮藏。微胶囊粒径在7～48 μm 之间，集中在14.8～26.7 μm，且呈正态分布（图8）。灰分含量为2.04%±0.14%。

图7 南极磷虾油微胶囊吸湿性曲线Fig.7 Hygroscopicity curve of Antarctic krill oil microcapsules

图8 南极磷虾油微胶囊粒径测定结果Fig.8 Results of particle size measurement of Antarctic krill oil microcapsules

2.5 pH 对南极磷虾油微胶囊机械强度的影响

通过考察南极磷虾油微胶囊在不同pH 环境下的释放，评价pH 对南极磷虾油微胶囊机械强度的影响，以便为南极磷虾油微胶囊产品的制备和应用提供参考。图9 描述了不同pH 条件下南极磷虾油微胶囊芯材在离心过程中的释放情况。由图9 可以看出，在不同的pH 环境和离心时间条件下，微胶囊中南极磷虾油释放率小于0.3%，释放量几乎可以忽略，表明南极磷虾油微胶囊的机械强度和抗离心能力非常强，结构非常稳定。微胶囊的强度取决于胶囊的直径和囊壳的厚度，也与壁材关系密切[22]。推测微胶囊机械强度高的原因是明胶使酪蛋白酸钠溶胶体系重组而改变原有的聚合物空间结构，两性亲水物质酪蛋白酸钠和明胶之间的生物相容性、协同增效作用增强，使微胶囊囊壁的机械强度显著性提高[23]。酪蛋白酸钠和明胶两种分子间的氢键作用，使囊壁的膜结构更加紧凑，阻水性明显提高；明胶侧基-NH3+与酪蛋白酸钠解离的负离子间静电力相互作用，使囊壁的拉伸强度提高[23]。

图9 不同pH 环境下南极磷虾油微胶囊芯材释放率随离心力时间的变化Fig.9 Variation of Antarctic krill oil microcapsules release rate versus centrifugation time in different pH conditions

3 结论

本实验利用喷雾干燥法制备南极磷虾油微胶囊，在单因素实验的基础上，利用响应面试验确定了南极磷虾油喷雾干燥法微胶囊化的最佳配方工艺为：酪蛋白酸钠用量24.55%、明胶用量4.86%、芯壁比0.33，麦芽糊精质量分数为45.60%，此条件下得到的南极磷虾油包埋率为93.79%。微胶囊水分含量2.31%±0.12%，吸湿性强，需储存于干燥密闭的环境里，灰分含量为2.04%±0.14%，粒径在14.8～26.7 μm之间。微胶囊机械强度高，结构稳定，初步认为可应用于食品加工。根据响应面试验结果，得出酪蛋白酸钠用量、明胶用量、芯壁质量比对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响极显著，且三者对南极磷虾油微胶囊包埋率影响大小顺序依次为：芯壁比>明胶>酪蛋白酸钠，各实验因素对南极磷虾油微胶囊包埋率的影响程度并非简单的线性关系。本文所建立预测模型可以用于南极磷虾油微胶囊包埋率的预测。