青海八眉猪DRD1基因多态性与其生长性状和产仔数的关联分析

沈文娟，王 磊，薛星星，韩启春，姚志芳，何江波，吴国芳*，吴 森*

(1.青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

多巴胺受体1(dopamine receptor D1，DRD1)是一种典型的G蛋白偶联受体，对胚胎早期发育起着决定性作用，特别是神经干细胞的发育[1]。DRD1在鹅的心、肾、肠、肌肉、脂肪、垂体、下丘脑、子宫、输卵管等组织广泛表达[2]。王翠等[3]以10个鸭品种为研究对象，对DRD1基因突变位点进行PCR-SSCP分析，发现DRD1变异位点与鸭的繁殖性状、产蛋、脂肪代谢存在显著相关；徐海平[4]研究发现DRD1及DRD2基因与开产日龄极显著相关；白优等[5]对江香猪DRD1基因多态性开展研究并进行生物信息学分析，探究了DRD1基因在不同品种猪中的多态性差异；Wang等[6]研究发现DRD1基因C681T突变与鸭产蛋体重显著相关，而内侧杏仁核中DRD1水平的变化可以引起草原田鼠性行为变化[7]。在通过GWAS研究蛋鸡胚胎发育相关研究中，发现DRD1的SNPs(single nucleotide polymorphisms)可能与蛋鸡的蛋品质有关[8]，敲除DRD1基因后鸡的攻击性行为显著降低[9]。DRD1 G123A的SNP与匈牙利黄鸡的体重、蛋品质有关[10]。研究发现肉鸡DRD1 C201T、A208G、A255G处的SNP与性成熟显著相关[11]；通过对多巴胺受体基因多态性与鸡繁殖性状的关联分析，G1073A与300日产蛋量、首次就巢日龄显著相关[12]。樱桃谷鸭、兴义鸭DRD1 T189C、T507A的SNP与体重、体斜长、胸深等性状显著相关[13]，且与血清总蛋白、球蛋白、白蛋白、白/球比、低密度脂蛋白及肌胸pH24h和剪切力显著相关[14]。目前对DRD1的研究大多数集中在人和禽类中，而关于DRD1和猪相关性状的研究报道较少。

猪的DRD1基因定位于猪第16号染色体，全长4 168 bp，包含两个外显子区域，参考序列为GeneBank No.：NC_010458.4。其蛋白(GeneBank No.：NP_001116580.1)由446个氨基酸组成，存在糖基化和多个跨膜结构等功能性结构域，多巴胺主要与多巴胺受体结合发挥作用，进而引起动物相应生理变化[15]。青海八眉猪作为八眉猪的高原类群，具有产仔数高，母性好的优点。因此，结合DRD1前期的功能性研究，运用现代生物技术对猪DRD1基因进行多方位功能分析，检测青海八眉猪DRD1所有外显子片段的SNPs，并将其与相关生产、繁殖性状进行关联分析，以期为青海八眉猪的分子辅助选育工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

试验所用333头纯繁八眉猪母猪来自青海省互助八眉猪原种育繁场，试验猪群养殖背景一致、体重接近、健康状况良好、三代以内无亲缘关系、经产2胎次以上。采集耳组织，使用天根组织DNA 试剂盒(Tangen，北京)提取DNA，-20 ℃保存待用。

1.2 生长性状、繁殖性状测定

测定并记录青海八眉猪生长性状：利用软尺及测杖测定并记录体长、体高、胸围、臀围，背膘厚(兽用背膘仪(B超)测量)，数据测定3次；繁殖性状：经产母猪产仔数统计平均产仔数，记录并统计两侧乳头平均数，具体方法参考李良华等[16]的研究。

1.3DRD1生物特征信息分析

NCBI检索猪及相关常见模式哺乳动物序列：人(NP_000785.1，Homosapiens)、小鼠(NP_034206.1，Musmusculus)、大鼠(NP_036678.3，Rattusnorvegicus)、牛(NP_776467.1，Bostaurus)、猪(NP_001116580.1,Susscrofa)、斑马鱼(NP_001129448.1，Daniorerio)。使用MEGA X软件(version 10.1.7)，采用MUCLE法进行多序列比较；使用泊松模型以邻接法构建系统进化树，研究物种进化关系[17]，结果采用CLC Sequence view (version 8.0)进行数据可视化。通过MEME suit(version 5.1.1)在线软件(http://meme-suite.org/)检测多物种DRD1蛋白二级结构中功能性motif结构[18]，其结果以TBtools(version 0.6735)进行可视化。使用STRING数据库(version 11.0)(https://string-db.org/)挖掘猪DRD1及直接互作蛋白的互作作用，挖掘DRD1主要功能[19]，STRING网络互作结果以Cytoscape(version 3.7.2)进行可视化[20]；功能富集结果以R(version 3.6.3)的dplyr(version 0.8.5)进行整理，以cowplot(version 1.0.0)和ggplot2(version 3.3.0)进行可视化；功能富集条目少于20条直接输出，多于20条的仅输出Top20。采用NCBI CDD(Conserved Domains)数据库进行蛋白质保守性结构域检测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)[21]，其结果以TBtools进行可视化。

1.4DRD1目的基因PCR扩增及SNP检测

针对猪DRD1基因全部外显子区域(NM_001123108.1)，使用Primer Premier5软件设计PCR扩增引物，引物序列见表1。

随机挑选30个DNA样品，吸取等量DNA组成混合样本。以DNA混合样本为模板进行PCR扩增，产物用1.0 %琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR反应体系20.0 μL，包括：2×Primer STAR Max Premix 10.0 μL，ddH2O 7.4 μL，上游、下游引物各(10 pmol/μL) 0.8 μL、模板 DNA( 50 ng/μL )1.0 μL。循环方案为95 ℃，5 min(预变性)；94 ℃ 30 s(变性)；55.0 ℃ 30 s(退火)，具体见表1；72 ℃ 1 min(延长)；72 ℃ 10 min(终延伸)，4 ℃保存。符合测序标准的产物交由上海美吉生物工程技术服务有限公司测序。测序结果通过DNA STAR software (version7.1) 软件进行序列比对及分析。根据检测结果，逐个对333个样本中存在SNP片段进行检测。

在专教中，进门设有一块黑板，便于老师上课时指导学生教学使用，黑板前上方有投影，为老师的信息化教学提供了很好的硬件设备，教室后角落放有物品架，可供学生放置个人物品，桌间有挡板与邻座相隔形成的私密空间，为学生提供一定的私人空间，专教的门属于密码防盗门，使得专教安全性提高，专教出门为阳台走廊，为学生在学习繁忙中提供了一个缓解放松的地方，走廊外墙设有展示墙，可将学生优秀作品进行展示，营造一个浓厚的学习氛围，专教内虽未设置大面积的落地玻璃，但开有许多窗，仍具有很好的采光效果。

表1 DRD1引物及PCR扩增信息Tab.1 DRD1 primer and amplification of PCR

1.5 统计分析

在鉴定SNP的基础上，关联八眉猪生长性状、繁殖性状，采用SPSS (version 26)软件统计关联结果，以P<0.05为差异显著水平；一般线性模型参考吴森等[22]研究：表型值=群体均值+标记基因型效应+年龄效应+胎次效应+随机误差。

2 结果与分析

2.1 猪DRD1蛋白及其近缘物种序列特征

多序列比对结果显示，猪DRD1蛋白与人、大鼠、小鼠、牛、斑马鱼等动物的DRD1在蛋白质一级结构上存在大量保守性片段(图1)；在二级结构上存在大量显著的保守性motif结构(图2)；在三级结构上存在一个相同的PHA03087保守性功能结构域(图3)。DRD1在猪及其近缘物种中结构相对保守，所以各物种DRD1功能可能相似。

图1 猪及其近缘物种DRD1一级结构比对Fig.1 Comparison of primary structure of DRD1 between pigs and related species

图2 猪及其近缘物种DRD1二级结构中保守性motif比对Fig.2 Comparison of conservative motif in the secondary structure of DRD1 between pigs and related species

图3 猪及其近缘物种DRD1三级结构中保守性结构域比对Fig.3 Comparison of conserved domains in the tertiary structure of DRD1 between pigs and related species

2.2 猪DRD1蛋白遗传进化分析

图4结果显示，在物种遗传进化方面，猪DRD1蛋白与牛进化关系最近，与斑马鱼最远。

图4 猪DRD1蛋白进化分析Fig.4 Evolutionary analysis of DRD1 protein of pigs

STRING网络互作结果显示，猪DRD1蛋白与CRH、NPS、ADCY4、ADCY9等10个蛋白有很强的相互调控作用(图5)。由图6可知，通过KEGG富集发现，猪DRD1蛋白主要与昼夜节律、慢性吗啡中毒、松弛素信号通路、γ-氨基丁酸能突触、神经活性配体-受体相互作用等有关。通过GO富集发现，猪DRD1蛋白在参与生物进程BP(biological process，BP)方面，主要在G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶激活G蛋白偶联受体信号通路、细胞信号传递、信号转导等活动中发挥作用；在分子功能MF(molecular function，MF)方面，DRD1蛋白主要在G蛋白偶联受体活性、激素活性、神经肽激素活性、分子功能调节剂等方面发挥作用；在参与细胞组成CC(cellular component，CC)方面，DRD1蛋白主要在胞外区、质膜、质膜的组成成分、细胞组分等活动中发挥作用。

图5 猪DRD1蛋白直接互作蛋白Top10Fig.5 Top10 direction interaction protein of DRD1 protein of pigs

图6 猪DRD1蛋白及直接互作蛋白(Top50)主要功能富集Fig.6 Main functional enrichment of DRD1 protein of pigs and direct interaction protein (Top50)

2.4DRD1基因外显子区域SNP检测

测序结果如图7所示，在DRD1基因外显子区域检测到1个SNP。但在青海八眉猪DRD1基因的1159处存在2种突变类型，分别标记为Type1(g.1159C>T)和Type2(g.1159C>G)。

图7 青海八眉猪DRD1外显子SNP位点检测图Fig.7 Detection of SNP of DRD1 exon of Qinghai Bamei pigs

2.5DRD1基因多态性分析

由表2可知，在DRD1基因中，Type1与Type2均有3种基因型CC、CT、TT和CC、CG、GG；A、T和C、G两种等位基因频率分别为71.4%、28.6%和87.7%、12.3%；第一种突变型g.1159C>T，经哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)卡方检验处于平衡状态，通过长期进化和选择，群体遗传未受到人工干预和遗传漂变，选择压力小；Ho观测杂合度基本和He期望杂合度具有差异，处于低杂合程度，SNP中突变影响力中等；有效等位基因数Ne分别为1.691、1.275，即在理想群体下，一个基因座上产生该突变相同的纯合率分别需要1.691、1.275个等位基因；突变位点PIC值0.25G的突变型个体较少，PIC<0.25，属于低度多态性，突变程度小，选择压力大。

表2 DRD1在八眉猪中的基因型和突变频率分布Tab.2 Genotype and mutation frequency distribution of DRD1 in Bamei pigs

2.6DRD1基因SNP关联生产性能、繁殖性能分析

由表3可知，DRD1基因两种突变型，由于Type2型突变个体较少，主要探究Type1型突变。Type1型突变与产仔数显著相关(P<0.05)，突变纯合型产仔数最多，可达10.2头；其突变纯合型TT产仔数显著高于野生纯合CC和杂合CT型(P<0.05)，在后续分子标记辅助育种中可以考虑将DRD1作为八眉猪产仔性状相关的候选基因，g.1159C>T型为主要选育基因型类型。而该突变与八眉猪的体尺等生长性状无显著关系(P>0.05)。

表3 DRD1基因SNP位点与性状的关联分析Tab.3 Correlation analysis of SNP sites of DRD1 gene and traits

表3(续)

3 讨论与结论

DRD1是儿茶酚胺及苯乙胺家族的一类化学物质，作为一种G蛋白偶联受体蛋白，在机体垂体、下丘脑、子宫、输卵管等组织中广泛存在[1,2]，可直接影响胚胎早期发育[1,8]。在一些成熟机体中，DRD1的SNP与性成熟有关[11]，在朱丽莉等[12]的研究中，DRD1与鸡的产蛋量、就巢日龄等繁殖性状呈显著或极显著相关。本研究通过对DRD1基因多态性与八眉猪生长性状、产仔数进行相关性分析，发现DRD1基因多态性与产仔数显著相关。白优等[5]通过对香江猪种DRD1外显子区多态位点分析，证实在哺乳动物间该基因序列差异较小，说明DRD1基因序列具有相对保守性。动物的性成熟和其他繁殖行为与机体的激素水平有直接关系。垂体前叶分泌的糖蛋白卵泡刺激素(follicle stimulating hormone) 与颗粒细胞上的受体相互作用，刺激雌性动物卵巢卵泡的成熟和分化，可影响二花脸猪的产仔数[24]。从DRD1的主要表达组织垂体、下丘脑、子宫、输卵管等来看，其可能影响机体对激素的分泌，刺激性器官，从而影响繁殖性能。另外，机体内分泌的平衡也可能导致繁殖性能的差异。例如，芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor)可介导免疫系统的平衡、细胞的生长与增殖等多种体内生物学过程，与产仔数也存在相关性[23]。

本研究通过对八眉猪DRD1基因一个突变位点的两种突变型与繁殖性能多态性分析，发现Type1(g.1159C>T)为主要突变类型。Type1型突变纯合型TT产仔数显著高于野生纯合CC和杂合CT型，Type2(g.1159C>G)型突变数量较少，推测可能是检测群体为人工选育型群体，由于突变导致繁殖性能下降或对胚胎有致死效应，在长期选育过程中被逐渐淘汰。检测群体为青海省互助八眉猪原种育繁场的种猪群体，在长期选育过程中，由于突变个体生产、繁殖性能低下逐渐淘汰机制，突变杂合子个体太过稀少或未包含纯合个体而被淘汰。关于DRD1基因多态性对母猪产仔数影响的报道有限，且所研究的SNP位点数量较少，研究结果不尽一致。本试验基于DRD1基因的多态性检测及关联分析，初步推断DRD1多态性对产仔数有显著影响，但由于品种及具体性状不同而有一定差异，也可能是因为人工选择在一定情况下内分泌系统平衡遗传力逐步积累的结果。DRD1基因的具体效应如能进一步筛查确认，并在不同猪群中研究检测，将有助于深入了解DRD1基因与繁殖性状的相关性，使其在育种工作中发挥重要作用。

综上所述，经多年人工选育，DRD1基因在青海八眉猪中存在多态性，其g.1159C>T为主要突变型。g.1159C>T与青海八眉猪的产仔数显著相关，其TT型群体表现出最高的产仔数，平均为10.2头。DRD1可作为候选基因，应用于实际生产的群体选育，为青海八眉猪的分子标记辅助选择提供理论参考。