抗原致敏DC-CIK细胞对肺癌细胞的体外杀伤作用

马庆庆

(贵州航天医院中心实验室，贵州 遵义 563000)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高居前列，多数患者确诊时已处于晚期，沿用传统治疗方案并未显著延迟患者生存期[1-5]。肿瘤免疫治疗是目前肿瘤研究的新思路，树突细胞(dendritic cells,DC)是抗原提呈细胞(Antigen Presenting cell,APC)，可激发机体T细胞应答，在机体抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用[6]；细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,CIK)兼具T细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤的特点[7-8]，DC和CIK细胞体外联合培养具有强大的抗肿瘤作用。本研究以人肺癌细胞抗原致敏的DC诱导出特异性CIK细胞(DC-CIK)，探讨DC-CIK细胞对肺癌细胞的体外杀伤作用，同时测定细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平，旨在为肺癌的特异性细胞免疫治疗提供基础依据。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取健康体检者20例，性别、年龄随机分布。排除标准：①肺结核、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制药物等患者；②孕妇或哺乳期妇女；③HBV、HCV、HIV 感染者或(和)AIDS 患者。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器：流式细胞分析仪(Beckman Coulter，美国)，血细胞分离机(Fresenius，德国)，CO2细胞培养箱(Thermo，美国)，倒置显微镜(Olympus，日本)，台式低速大容量离心机(湘仪，中国)。

1.2.2主要试剂：Ficoll-人淋巴细胞分离液(Solarbio，中国)，RPMI-1640培养基(Gibco，美国)，胎牛血清(Gibco，美国)，重组细胞因子(IFN-γ、TFN-α、GM-CSF、IL-4、IL-2)(Pepro Tech，美国)，Anti-CD3McAb(北京同立海源生物，中国)，检测T细胞亚群各种抗体(Beckman Coulter，美国)，CCK-8试剂盒(碧云天生物，中国)，ELISA试剂盒(R&D systems，美国)，人肺癌A549细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，中国)。

1.3方法

1.3.1效应细胞分组：将效应细胞分为三组:A组为肺癌A549细胞抗原致敏的DC-CIK细胞，B组为未致敏的DC-CIK细胞，C组为单纯CIK细胞。

1.3.2肺癌A549细胞抗原制备:将人肺癌A549细胞株加入含10%灭活胎牛血清RPMI-1640培养基中培养，对数期细胞制细胞悬液，反复冻融3次，低温超声破碎，离心收集上清液，过滤灭菌(孔径0.22 μm)，-80℃保存。

1.3.3DC和CIK 细胞诱导培养：健康成人外周血经Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞(PBMC)，37 ℃、5% CO2RPMI-1640 培养基中培养4 h 后收集悬浮细胞(用于CIK 细胞培养)，加入1 000 U/ml IFN-γ、500 U/ml IL-2、500 ng/ml Anti-CD3McAb 于37 ℃、5% CO2 培养；而贴壁细胞(用于DC诱导培养)加入1 000 U/ml GM-CSF、1 000 U/ml IL-4、1 000 U/ml TNF-α于37 ℃、5% CO2培养。

1.3.4肺癌抗原致敏DC-CIK细胞培养：DC 诱导培养第6天加入1.3.2制备的肿瘤抗原，37 ℃、5%CO2培养，第8天收集肺癌A549细胞抗原致敏DC、未致敏DC，按DC∶CIK = 1∶10 比例将DC按实验分组分别与CIK 细胞混合共培养。

1.3.5细胞免疫表型检测:收集DC、CIK细胞，PBS细胞悬液加入FITC 标记的上述鼠抗人单抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测DC(第0天、第8天)、CIK 细胞(第0天、第14天)的免疫表型。

1.3.6细胞杀伤活性的检测：以CCK-8 比色法检测对照组不同效应细胞对靶细胞肺癌A549的杀伤活性。效靶比依次为15∶1、25∶1、50∶1，按实验分组铺板，设3个复孔，37 ℃、5%CO2培养4 h，每孔取5 μl上清加CCK-8 溶液，孵育4 h，用酶标仪在450 nm 波长测量各孔OD值。杀伤活性(%)=[1-(实验孔OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]× 100%

1.3.7细胞因子分泌水平测定:以ELISA法检测对照组不同效应细胞因子的分泌水平。取1.3.6未加CCK-8溶液的10 μl上清液，按R&D systems ELISA 试剂盒说明书测IL-12和IFN-γ细胞因子的分泌水平。

2 结果

2.1细胞形态及免疫表型：PMBC常规培养后，悬浮细胞诱导培养3d后，成熟CIK细胞呈圆形，胞体饱满透亮，聚集成细胞团状，随着培养天数增加细胞团增大；贴壁细胞诱导培养7d，单个圆形细胞随培养天数增加不断增大，DC细胞成熟后表面具树突状突起。

流式细胞仪检测细胞免疫表型发现随着培养时间增加，细胞表型CD3+CD8+的表达持续增高。培养14 d后，流式细胞检测结果显示：A组(Ag-DC-CIK)CD3+CD8+表达最高(80.2%)，B组(DC-CIK)、C组(CIK)CD3+CD8+表达分别为68.5%、53.3%。

2.2肺癌细胞杀伤活性测定：三组效应细胞培养至14 d，对肺癌A549细胞杀伤活性进行检测，结果显示各组效应细胞都随着效靶比的增高杀伤力增强，A组(Ag-DC-CIK)效应细胞在不同效靶比较B组(DC-CIK)和C组(CIK)都具更强杀伤能力(P<0.05)，见表1。

表1 各组效应细胞杀伤活性比较

2.3细胞因子分泌水平测定:当效靶比为50∶1时，各组效应细胞对肺癌A549细胞杀伤活性最强，同时测定其细胞因子分泌水平。各组细胞在抑制肺癌细胞的同时，细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌都有所增加，A组IL-12、IFN-γ的分泌水平较B组和C组更高(P<0.05)，见表2。

表2 各组效应细胞因子分泌水平比较

3 讨论

近年来，肿瘤相关研究中免疫治疗是一个重要的新研究方向，抗原冲击的DC可激发机体的抗原特异性T细胞反应，增强CIK细胞的细胞毒作用[6]；CIK细胞的增殖效率和杀瘤活性较高[7-8]，研究表明CIK细胞能增强肺癌患者免疫功能，提高生存率[9-10]，现已应用于不少肿瘤的临床治疗中。大量研究已证实DC负载自体肿瘤抗原与CIK细胞共培养后可诱导机体产生更强特异性抗肿瘤免疫效应，在肾癌、乳腺癌、小细胞肺癌、肺腺癌、肝癌、食管癌、黑色素瘤等肿瘤研究中取得较好疗效[11-14]。

本研究用人肺癌A549细胞抗原致敏的DC与同源CIK细胞共培养，对靶细胞肺癌A549细胞进行体外杀伤活性检测，探讨抗原致敏CD-CIK细胞对肺癌细胞的杀伤作用，同时测定细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌水平。流式细胞术测定免疫细胞表型，结果显示肺癌抗原致敏DC-CIK细胞组具杀伤活性的CD3+CD8+细胞占比最高(P<0.05)，与既往研究相符。体外肺癌细胞杀伤实验中，在效靶比(15∶1)～(50∶1)范围内，随着效靶比的增高细胞杀伤活性增强，肺癌抗原致敏DC-CIK细胞组在不同效靶比具更强杀伤能力，且随着效靶比的升高杀伤能力增强(P<0.05)。细胞因子IL-12和IFN-γ是具有多重生物活性的抗肿瘤细胞因子，具有多种免疫调节功能，测定三组效应细胞的IL-12和IFN-γ分泌水平，肺癌抗原致敏DC-CIK细胞组细胞因子IL-12和IFN-γ分泌水平最高(P<0.05)。结果证实肺癌抗原致敏DC-CIK细胞可增强抗肺癌免疫应答，提高CIK细胞特异性杀伤肺癌细胞能力。

因此，本研究通过对比肺癌抗原致敏DC-CIK、未致敏DC-CIK和CIK细胞在肺癌杀伤作用，同时测定具抗肿瘤活性的细胞因子分泌水平，初步探究抗原致敏DC-CIK细胞对肺癌细胞具有较强杀伤作用，为肺癌免疫治疗提供基础数据，为后续临床研究提供参考。