葛根总黄酮对佐剂性关节炎大鼠免疫器官指数、IL-1β及TNF-α的影响分析

柏 琳，邹天琪，张成义

(北华大学药学院，吉林 吉林 132000)

葛根主要活性成分有皂苷、黄酮、多糖、生物碱等。葛根总黄酮包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮。目前研究发现，黄酮类化合物具有抗炎、清除自由基、抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力等功效[1]。因此可推测葛根总黄酮具有一定的抗炎活性。本研究采用弗氏完全佐剂建立佐剂性关节炎大鼠模型，探讨葛根总黄酮对佐剂性关节炎大鼠免疫器官指数、IL-1β及TNF-α的影响。

1 资料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：清洁级雄性SD大鼠60只，体质量190～210 g，购于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK(吉)2018-0001。灯光模拟昼夜交替，温度23～25 ℃，湿度50%～60%，自由饮水和进食。

1.1.2主要试剂：葛根总黄酮购自四川维克奇生物科技有限公司，甲氨蝶呤片购自上海信谊药广有限公司，弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司，IL-6酶联免疫吸附试剂盒和TNF-α酶联免疫吸附试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1分组与模型制备：实验动物分组：60只SD大鼠，适应性喂养1周后，采用随机数字法分为正常对照组12只，模型组48只。

1.2.2给药剂量和方案：葛根总黄酮：大鼠(50 mg/kg、100 mg/kg)；阳性对照药甲氨蝶呤：大鼠(3 mg/kg)；通过查阅相关文献并参照前期预实验，给药剂量均为人体常用有效剂量经体表面积折算。将不同浓度的葛根总黄酮混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠中，在对应组致炎后(第12天)连续给药16 d(第12～28天)，均按10 ml/kg计量灌胃给药，正常对照组和模型组给予等量溶媒0.5%的羧甲基纤维素钠灌胃，1次/d。

1.2.3大鼠免疫器官指数测定：造模后第28天，摘取大鼠脾脏和胸脾，生理盐水反复冲洗后，纱布吸干，使用分析天平称量湿重，计算免疫器官指数，包括脾脏指数和胸脾指数。计算公式为免疫器官指数=器官湿重(mg)/体重(g)×100%。

1.2.4大鼠血清IL-1β和TNF-α水平检测：造模后第28天，心脏采血5 ml，注入离心管中，4 ℃静置过夜，3 000 r/min离心20 min，采集上层血清，-20 ℃保存待测。采用酶联免疫吸附法测定血清IL-1β、TNF-α水平，按试剂盒说明书依次加入反应液，上酶标仪读取450 nm处的吸光度值。同时使用标准品绘制标准曲线，将吸光度值代入标准曲线方程计算出相应的浓度。

1.3统计学方法：统计分析采用SPSS 24.0软件分析。计量数据为均数Mean、标准差STD、中位数Median，采用双样本t检验比较两组间计量数据的统计学差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1葛根总黄酮对佐剂性关节炎大鼠多发性关节炎的影响：模型组大鼠多发性关节炎指数明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；自给药干预20 d后，与模型组大鼠相比，葛根总黄酮低剂量组、葛根总黄酮高剂量组、阳性对照组大鼠的多发性关节炎指数明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；其中葛根总黄酮高剂量组和阳性对照组大鼠多发性关节炎指数明显低于葛根总黄酮低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；大鼠多发性关节炎指数在葛根总黄酮高剂量组与阳性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同给药时间各组大鼠多发性关节炎指数比较

2.2葛根总黄酮对佐剂性关节炎大鼠免疫器官指数的影响：给药干预28 d后，模型组大鼠脾脏指数、胸脾指数均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组大鼠相比，葛根总黄酮低剂量组、葛根总黄酮高剂量组、阳性对照组大鼠的脾脏指数、胸脾指数均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；其中葛根总黄酮高剂量组和阳性对照组大鼠脾脏指数、胸脾指数明显低于葛根总黄酮低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；大鼠脾脏指数、胸脾指数在葛根总黄酮高剂量组与阳性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 干预28 d后各组大鼠免疫器官指数比较

2.3葛根总黄酮对佐剂性关节炎大鼠血清IL-1β和TNF-α的影响：给药干预28 d后，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组大鼠相比，葛根总黄酮低剂量组、葛根总黄酮高剂量组、阳性对照组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；其中葛根总黄酮高剂量组和阳性对照组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显低于葛根总黄酮低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)；大鼠血清IL-1β、TNF-α在葛根总黄酮高剂量组与阳性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 给药干预28 d后各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比较

3 讨论

佐剂性关节炎动物模型能够较好地模拟人的类风湿性关节炎表现，其中大鼠佐剂性关节模型应用最为广泛，适用于研究和筛选抗炎免疫药物。继发性足肿胀、多发性关节炎时反映大鼠继发性炎性反应的两个主要指标。相关研究显示，中枢免疫器官胸腺功能异常是类风湿性关节炎的主要发病机制之一，胸腺是T细胞分化、成熟的场所，当其功能异常时会影响T细胞水平，影响人体正常的免疫炎症状态[2]。除胸腺之外，脾脏是另一个功能复杂的免疫器官，在人体神经内分泌免疫调节中发挥重要作用[3]。胸腺和脾脏是重要的免疫器官，胸腺和脾脏指数水平取决于淋巴细胞增殖的程度，可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱[4]。关节炎发病早期IL-1β、TNF-α是关键调控分子[5]。相关研究显示，IL-1在类风湿性关节炎的发病过程中发挥重要调控作用，其水平与类风湿性关节炎病情严重程度呈正相关[6]。IL-1主要由IL-1α、IL-1β两种蛋白质组成，两者的基因序列同源性并不高，其中IL-1β在类风湿性关节炎中高表达，能够激活软骨细胞、内皮细胞、白细胞，诱发趋化因子、细胞因子的释放[7]。同时还能够调控内皮细胞黏附分子表达，合成并分泌急性期蛋白，提升糖代谢水平，引发钙流失、发热、关节炎性反应和骨破坏。TNF-α是类风湿性关节炎滑膜组织中主要的促炎因子，能够引发级联反应；患者血清TNF-α水平提升会增加滑膜炎、关节损坏的发生等下。TNF-α还能够活化内皮细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞，诱导趋化因子、细胞因子、基质金属蛋白酶等合成与分泌，抑制滑膜胶原合成及成纤维细胞增殖，诱导产生急性期蛋白，促进血管生成和T细胞活性提升，诱发疼痛[8]。近年来研究发现，IL-1β 和 TNF-α在直接引发关节损伤和全身性炎症反应的同时，还能够与其他炎性介质之间产生协同作用，诱发级联放大反应[9]。

葛根是我国的传统中药材，是野葛干燥的根，具有生津止渴、解肌退热之功效。葛根总黄酮由葛根素、大豆甙等黄酮类化合物组成，是葛根发挥药效学作用的主要活性成分。本研究成功建立了佐剂性关节炎大鼠模型，并以甲氨蝶呤干预作为阳性对照组。研究结果显示，葛根总黄酮低剂量组和高剂量组均能够明显抑制佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀，降低多发性关节炎指数和脾脏指数、胸脾指数，其中葛根总黄酮高剂量组大鼠改善效果较葛根总黄酮低剂量组大鼠更明显，与甲氨蝶呤阳性对照组无明显差异。提示葛根总黄酮能够有效改善佐剂性关节炎大鼠的症状，且改善效果呈剂量依赖性，随着给药剂量的增加效果逐渐明显。进一步分析显示，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明显高于正常对照组；与模型组大鼠相比，葛根总黄酮低剂量组、葛根总黄酮高剂量组、阳性对照组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明显下降；其中葛根总黄酮高剂量组下降最明显，与阳性对照组无明显差异。提示葛根总黄酮能够明显下调佐剂性关节炎大鼠致炎因子IL-1β、TNF-α的表达，降低大鼠血清中致炎因子含量，进而改善炎症症状。

综上所述，葛根总黄酮能够降低佐剂性关节炎大鼠继发性足肿胀，改善免疫器官指数，降低佐剂性关节炎大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，上述结论可为相关研究奠定理论基础。