复合酶制剂对新疆伊犁鹅产蛋性能和盲肠微生物菌群的影响

■赵晓钰 王俊花 高 雨 李海英杨 敏 马超宇 张九龙

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐830052）

肠道微生物系统作为动物肠道内最复杂的系统，其中的大量微生物参与养分的吸收和代谢，并影响动物生产性能和肠道健康[1]。动物肠道微生物可以产生大量益生菌，且肠道中的有益菌群在提高营养物质利用以及维护动物机体健康等方面起了很大的作用。程志斌等[2]研究表明，在蛋鸡日粮中添加1 g/kg非淀粉多糖酶（葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶和纤维素酶）和0.4 g/kg植酸酶，均可显著提高蛋鸡产蛋率，降低料蛋比。谭子超等[3]研究表明，在肉鸡小麦-豆粕型饲粮中添加3 g/kg复合酶制剂（木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶和植酸酶），可以显著提高21日龄和42日龄肉鸡肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，降低大肠杆菌的数量。以上研究说明，在家禽饲粮中添加一定比例的酶制剂，使可溶性非淀粉多糖（NSP），如纤维素、半纤维素、果胶等分解成可利用的糖类[4]，并能有效破坏细胞壁中非水溶性抗营养因子，进而有利于细胞内营养物质的释放，同时有效缓解水溶性NSP导致的食糜黏度过大，从而提高饲料利用率，提高家禽的生产性能。另外，酶制剂还可以促进家禽肠道内有益菌的增殖，减少有害菌的增殖[5-6]。伊犁鹅是我国唯一由灰雁驯化而来的家鹅品种，是优质的地方遗传资源[7]。因其产蛋性能较低，且就巢性强，远不能满足规模化生产及市场的需求[8]。本试验旨在探究饲粮中添加复合酶制剂对伊犁鹅产蛋性能及肠道菌群的影响，为复合酶制剂在伊犁鹅生产中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用复合酶制剂由深圳绿微康生物科技有限公司提供，主要成分为蛋白酶（3 000 U/g）、木聚糖酶（2 000 U/g）、纤维素酶（1 000 U/g）、甘露聚糖酶（800 U/g）、α-淀粉酶（500 U/g）、普罗兰酶（300 U/g）。

1.2 试验动物与试验设计

试验采用单因素试验设计，以健康状况良好、体重相近、饲养管理水平一致，并处于产蛋期的200只4岁伊犁鹅为试验对象，由新疆额敏县恒鑫实业有限公司国家级伊犁鹅保种场提供。随机分为4组，每组10个重复，每个重复5只鹅（公母比例1∶4）。各组间正试鹅初始产蛋率均无显著差异（P＞0.05）。对照组饲喂玉米-豆粕型饲粮，试验组在对照组的基础上分别添加0.2、0.3、0.4 g/kg的复合酶制剂。预试期7 d，试验期为35 d。试验分组见表1，基础饲粮组成及营养水平见表2。

表1 试验设计与分组

1.3 试验动物饲养管理

饲养试验在新疆额敏县恒鑫实业有限公司国家级伊犁鹅保种场进行，试验鹅采用单圈常规饲养方式，种鹅舍内有产蛋窝、食槽、地面运动场和水面运动场。试验期间，试验鹅自由采食和饮水，分2次投喂（每天08:00和16:00各喂料1次），投料后捡蛋并记录。

1.4 产蛋性能测定

每日准确记录各重复组试验鹅的饲料消耗量、总蛋重、总产蛋个数、不合格蛋数，根据饲养记录计算第2周（1～14 d）、第4周（1～28 d）及全期（1～35 d）的平均日采食量、平均日产蛋量、平均蛋重、产蛋率、料蛋比和商品蛋合格率。

表2 试验饲粮组成及营养水平（风干基础）

平均日采食量[g/(只·d)]=总耗料量（g）/（饲养天数×总鹅数）

平均日产蛋量（g/d）=总产蛋量（g）/饲养天数（d）

平均蛋重（g）=总产蛋量（g）/总产蛋数

产蛋率（%）=总产蛋数/（饲养天数×总鹅数）×100

料蛋比=总耗料量（kg）/总产蛋重（kg）

商品蛋合格率（%）=合格蛋数/总产蛋数×100

1.5 样品采集

在饲养试验结束的当天，从对照组和试验Ⅱ组（由前期试验产蛋数据可得，试验Ⅱ组为产蛋性能最佳组）中各随机选取8只体重接近的伊犁鹅，屠宰后迅速采集盲肠内容物，置于液氮中保存。对照组盲肠内容物样品分别命名为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7及A8，试验Ⅱ组盲肠内容物样品分别命名为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7及B8。

1.6 DNA提取与高通量测序

使用CTAB法对伊犁鹅盲肠内容物的DNA进行提取。使用细菌16S rRNA通用序列扩增16S rRNA V3～V4可变区。引物序列为341F：CCTAYGGGRBG⁃CASCAG；806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT。扩增程序：98℃预变性1 min；30个循环包括（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。纯化PCR产物，使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，文库合格后使用NovaSeq6000进行上机测序。测序得到的原始数据经过质量过滤，对通过质量过滤的序列进行连接，得到每个样品的有效序列。对有效序列进行进一步过滤和去除嵌合体处理，得到最终用于后续分析的优质序列。16SrRNA V3～V4可变区扩增和测序工作由诺禾致源生物技术有限公司完成。

1.7 数据统计与分析

采用Excel 2010软件、SPSS 20.0软件进行产蛋数据的统计与分析。采用Uparse7.0.1001软件、R2.15.3软件及Qiime 1.9.1软件等进行盲肠内容物菌群数据的统计及分析。

2 结果与分析

2.1 复合酶制剂对伊犁鹅产蛋性能的影响

表3 复合酶制剂对伊犁鹅产蛋性能的影响

由表3可知，在试验的第2周，试验各组之间在产蛋性能方面均差异不显著（P＞0.05）。在试验的第4周，与对照组相比，试验Ⅱ组产蛋率极显著提高81.37%（P＜0.01），与试验Ⅰ、Ⅲ组相比，试验Ⅱ组产蛋率分别显著提高33.80%（P＜0.05）、30.01%（P＜0.05）；与对照组相比，试验Ⅱ组料蛋比显著降低41.31%（P＜0.05）。综合全期，与对照组和试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组产蛋率分别显著提高33.33%（P＜0.05）和31.82%（P＜0.05）；与对照组相比，试验Ⅱ组料蛋比显著降低23.67%（P＜0.05）。其余各组各指标间均差异不显著（P＞0.05）。

2.2 复合酶制剂对伊犁鹅盲肠微生物菌群的影响2.2.1 数据预处理及质控

通过对reads剪切过滤，每个样品平均测得9.23×104条raw reads，并通过质量控制每个样品平均获得8.58×104条clean reads，序列的平均长度在418 bp，Q20均在97.83%以上，说明所得数据质量较好，能保证后续试验分析的可靠性。

2.2.2 盲肠微生物的OTUs注释结果(见图1)

图1 韦恩图

由图1韦恩图可知，对照组共获得2 133个操作分类单元（OTUs），复合酶制剂组共获得2 111个OTUs，分别占总OTUs个数的90.77%和89.83%。其中，对照组特有239个OTUs，复合酶制剂组特有217个OTUs，共有的操作分类单元(OTUs)有1 894个，占总OTUs个数的80.60%，说明两组伊犁鹅盲肠结构具有很高的相似性。

2.2.3 稀释曲线

由图2可知，在测序量达到49 000时，细菌稀释曲线接近平台期，即使有再多的数据量也只能产生很少的OTUs，表明当前的测序量能够很好地反映出样品中细菌群落结构和多样性。

2.2.4 肠道菌群Alpha多样性分析

将对照组和0.3 g/kg酶制剂组(试验Ⅱ组)样品所有序列按97%的相似度进行OTUs聚类，利用程序运算得到评价样品中群落丰富度和多样性的Alpha多样性指数(见表4)，Alpha多样性指数包括Chao 1指数、Shannon指数、Simpson指数和Goods coverage指数。由表4可知，对照组和0.3 g/kg酶制剂组间Chao 1指数、Shannon指数、Simpson指数和Goods coverage指数均差异不显著（P＞0.05）。

图2 稀释曲线

表4 盲肠微生物多样性指数分析

2.2.5 微生物丰富度和多样性的分析

2.2.5.1 复合酶制剂对盲肠内容物门水平菌群丰度的影响(见表5、图3)

表5 复合酶制剂对盲肠内容物门水平菌群丰度的影响(门水平%)

由表5和图3可知，在微生物分类门水平上，通过NovaSeq测序，检测到的前10个菌门中，对照组有6个优势菌群（丰度＞1%为优势菌群），分别是拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Pro⁃teobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）、疣微菌门（Verru⁃comicrobia）和放线菌门（Actinobacteria），其占比分别为45.20%、32.26%、11.17%、3.61%、1.11%和3.64%。复合酶制剂组有4个优势菌群，分别是拟杆菌门（Bac⁃teroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteo⁃bacteria）和放线菌门（Actinobacteria），其占比分别为54.76%、29.87%、10.14%和2.61%。以上结果表明，盲肠菌群中拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为主要菌门，复合酶制剂组拟杆菌门相对丰度极显著升高（P＜0.01），而梭杆菌门相对丰度极显著降低（P＜0.01）。

图3 对照组和0.3 g/kg酶制剂组在门水平上的相对丰度

2.2.5.2 复合酶制剂对盲肠内容物属水平菌群丰度的影响(见表6、图4)

表6 复合酶制剂对盲肠内容物属水平菌群丰度的影响(属水平%)

图4 对照组和0.3 g/kg酶制剂组在属水平上的相对丰度

由表6和图4可知，在微生物分类属水平上，检测到的前10个属中，对照组有9个优势菌群，分别是拟杆菌属（Bacteroides）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、梭杆菌属（Fusobacterium）、Peptoclostridium、unidentified_Ru⁃minococcaceae、Subdoligranulum、消化球菌属（Peptococ⁃cus）、Fournierella和Akkermansia。其 占 比 分 别 为22.10%、3.63%、3.61%、3.40%、3.14%、2.46%、1.65%、1.41%和1.09%。复合酶制剂组有6个优势菌群，分别是拟杆菌属（Bacteroidetes）、脱硫弧菌属（Desulfovi⁃brio）、unidentified_Ruminococcaceae、Fournierella、Sub⁃doligranulum和巨单胞菌属（Megamonas），其占比分别为32.00%、5.95%、3.50%、1.95%、1.82%和1.72%。以上结果表明，盲肠菌群中拟杆菌属为主要菌属，复合酶制剂组拟杆菌属相对丰度极显著升高（P＜0.01），而梭杆菌属相对丰度极显著降低（P＜0.01），脱硫弧菌属相对丰度显著增加（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 复合酶制剂对伊犁鹅产蛋性能的影响

饲料酶制剂主要是降解类的酶制剂，把抗营养物质[非淀粉多糖(NSP)和植酸盐]或营养物质（蛋白质和淀粉）降解为无抗营养特性的成分或容易吸收的营养成分[9]。玉米和豆粕中含有大量的NSP，添加酶制剂可去除饲料中的NSP，释放更多的营养物质，从而提高动物的生产性能。孙旺斌等[10]研究表明，在海兰褐蛋鸡日粮中添加0.4%的复合酶制剂（α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶等）可显著提高蛋鸡的产蛋率，降低料蛋比。宋连喜等[11]在蛋鸡日粮中添加0.1%的复合酶制剂（酸性蛋白酶、木聚糖酶、果胶酶等）可以使产蛋率显著提高，料蛋比显著降低。本试验结果表明，添加0.3 g/kg复合酶制剂可显著提高产蛋期伊犁鹅的产蛋率（P＜0.05），显著降低料蛋比，与上述孙旺斌[10]、宋连喜等[11]研究结果基本一致。可能的原因是在产蛋期伊犁鹅饲粮中添加复合酶制剂，可去除玉米-豆粕型饲粮中的NSP，释放更多的营养物质，维持肠道健康，从而提高动物的产蛋性能[12]。

3.2 复合酶制剂对伊犁鹅盲肠微生物菌群的影响

3.2.1 复合酶制剂对盲肠微生物菌群Alpha多样性的影响

肠道菌群多样性是促进营养物质吸收、维持机体免疫等生命活动的基础，多样性的增加有利于机体新陈代谢和免疫防御，进而有益于宿主健康[13]。Alpha多样性分析反映微生物群落的多样性和丰度[14]，Chaol指数和ACE指数用于评估菌群的丰度[15]。Shannon多样性指数越大，说明群落多样性越高[16]。Simpson指数越小说明样品中物种越丰富[17]，Goods coverage指数表示各样品文库的覆盖率，实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况[18]，Goods coverage指数均大于0.99，说明了该测序结果已基本覆盖样本的多样性[19]。本试验结果显示，对照组和0.3 g/kg酶制剂组间丰度指数、香农指数、辛普森指数和覆盖度指数差异不显著（P＞0.05），说明添加复合酶制剂未改变伊犁鹅盲肠内容物的多样性。

3.2.2 复合酶制剂对盲肠微生物菌群门水平的影响

盲肠在家禽糖类代谢和氮代谢的过程中起重要的作用，盲肠内的拟杆菌在帮助分解多糖、提高多糖利用率[20]、加快黏膜发育[21]及维持肠道微生态平衡[22]方面起到了积极的作用，较高丰度的拟杆菌有利于肠道中营养物质吸收[23]。梭杆菌包含坏死梭杆菌和核梭杆菌等多种致病菌，对动物具有毒害作用[17]。本试验通过盲肠微生物门水平的组成分析发现，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是盲肠微生物的主要组成部分，这与鹅[24]和鸡[19]盲肠中的微生物组成的报道相一致。Yan等[25]在扬州鹅饲粮中添加不同比例的发酵饲料，发现拟杆菌门丰度显著增加，可能与鹅的生产性能呈正相关。陈继发等[17]研究表明，在蛋鸡饲粮中添加0.9 g/kg蒙脱石可显著提高产蛋鸡日产蛋量（P＜0.05），同时盲肠中梭杆菌门的相对丰度也有一定程度降低。本试验在产蛋期伊犁鹅的日粮中添加复合酶制剂，极显著增加了伊犁鹅盲肠门水平上拟杆菌门的相对丰度（P＜0.01），极显著降低了梭杆菌门的相对丰度（P＜0.01）。饲粮中复合酶制剂的添加改善了产蛋期伊犁鹅的盲肠菌群结构，增加了有益菌的丰度，降低了有害菌的丰度，提高了营养物质的利用率，维持肠道健康。

3.2.3 复合酶制剂对盲肠微生物菌群属水平的影响

鹅消化纤维素的主要场所在盲肠，盲肠中含有大量降解纤维素的微生物，将纤维素分解为可被吸收的营养物质。研究发现，脱硫弧菌属具有很高的纤维降解能力[26]。本试验研究发现添加0.3 g/kg复合酶制剂显著增加了脱硫弧菌属的丰度（P＜0.05），提示添加复合酶制剂可提高伊犁鹅盲肠纤维素的降解能力。龙建华等[27]研究表明，拟杆菌属丰度的显著增加，提高了五龙鹅对糖类物质的分解和利用，进而提高五龙鹅的生长性能。蒲翠敏[28]在正常樱桃谷鸭与患鸭瘟病的樱桃谷鸭肠道微生物比较研究中，发现患病组较正常组梭杆菌属丰度显著增加（P＜0.05）。本试验添加0.3 g/kg复合酶制剂，试验鹅盲肠拟杆菌属的相对丰度得到了极显著增加（P＜0.01），而梭杆菌属的相对丰度极显著降低（P＜0.01），这与本试验盲肠微生物菌群在门水平上的结果相一致，表明添加复合酶制剂增加了产蛋期伊犁鹅盲肠内的有益菌的数量，降低了盲肠内有害菌的数量，有利于维持机体肠道的健康和营养物质的消化利用，这与本试验中伊犁鹅产蛋率的提高相印证。

4 结论

本试验条件下，在饲粮中添加0.3 g/kg复合酶制剂可显著提高伊犁鹅产蛋率，显著降低料蛋比，显著或极显著增加盲肠有益菌（拟杆菌门、拟杆菌属、脱硫弧菌属）的相对丰度，极显著减少有害菌（梭杆菌门、梭杆菌属）的相对丰度，有助于提高伊犁鹅肠道的消化吸收功能和预防肠道疾病，从而提高伊犁鹅的产蛋性能。