一株牦牛源粪肠球菌的分离鉴定及安全性评价

■钟 浪 孙金梅 张振伟 吴庆侠 董海龙 杨 飞* 曾江勇 马宏财

（1.西藏农牧学院，西藏林芝860000；2.西藏自治区农科院畜牧兽医研究所，西藏拉萨850000）

牦牛有着“高原之舟”之称，是西藏高原地区最具特色的经济动物之一，而犊牦牛腹泻病是牦牛养殖业中最为常见的疾病之一[1]，其轻度症状表现为腹泻、食欲不振、精神萎靡、高热、咳嗽等[2]；重度症状表现为机体脱水、便血、电解质平衡紊乱，甚至引起犊牦牛死亡，对养殖业影响较大。由于藏区牧民养殖技术整体落后，对该病的治疗多以抗生素为主，这导致该病的耐药性十分严重[3]。因此，寻找抗生素的替代药物十分迫切。

粪肠球菌（Enterococcus faecalis)为芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)肠球菌科(Enterococ⁃caceae)肠球菌属（Enterococcus)的兼性厌氧菌，是一种广泛存在于动物肠道内的益生菌群，对调节肠道菌群环境具有重要作用[4]。其调节肠道菌群的功能主要体现在可调节胃肠道微生态系统，提高家畜抗病性、生产性能[5]等，同时具有无残留、无污染和无耐药性等优点[6]。目前被广泛应用在医疗健康[6]、食品安全[7]等方面，分别于2008、2013、2018年被农业农村部收录在《饲料添加剂品种目录》内。有研究表明，优良的粪肠球菌菌株主要来源于动物机体内[8]，能快速定植并耐受胃肠道的复杂环境以发挥益生作用[9]。

本研究拟从健康牦牛的肠道内容物中分离纯化、筛选出具有防治犊牦牛腹泻病的粪肠球菌菌株，对其安全性进行评价，并通过抑菌试验、动物回归实验验证分离株对犊牦牛腹泻性疾病的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

粪肠球菌（E.faecalis）S-5：由西藏农牧学院兽医重点临床实验室分离自健康牦牛粪便，现保存于-80℃冰箱中。

抑菌试验指示菌株：大肠杆菌O111菌株、大肠杆菌O78菌株购自西藏农牧学院预防实验室；金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923购自广东环凯微生物科技有限公司；表皮葡萄球菌由西藏农牧学院兽医重点临床实验室分离所得。

1.1.2 试验动物健康犊牦牛4头，4～6月龄购自西藏林芝市巴宜区百巴镇色贡村永珠罗布藏牦牛养殖合作社。

1.1.3 培养基

粪肠球菌固体培养基（规格250 g/瓶）、粪肠球菌液体培养基（规格250 g/瓶），购自凡科维(上海)科技有限公司。

1.1.4 药品试剂

成套粪肠球菌生化鉴定管，购自青岛海博生物有限公司；胰蛋白酶，购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；牛胆盐，购自杭州宝积生物科技有限公司。

1.1.5 设备

BAC-GZT-B01超净工作台购自广州佰伦净化设备制造有限公司；LRH-150恒温培养箱购自金坛市盛蓝仪器制造有限公司；BXM-30R高压蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BCD-230SDCY超低温冰箱购自青岛海尔股份有限公司；TDZ5-WS高速冷冻离心机购自金坛市鸿科仪器厂；AZ-8685 pH计购自台湾衡欣有限公司；Thermo Sci⁃entific™Multiskan™FC酶标仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化

将冻存于-80℃冰箱的粪肠球菌S-5的冻存管取出，冻存管恢复室温后接种于粪肠球菌固体培养基活化24 h后，转接于粪肠球菌液体培养基，接种后总体积为10 mL(1 mL+9 mL)，于37℃下培养24 h获得活化菌株，最后使用平板稀释计数法记录细菌活化数。

1.2.2 形态学鉴定及溶血性分析

将所得疑似菌株做革兰氏染色，于光学显微镜100×油镜下检查并拍照记录。使用新鲜绵羊血液制作哥伦比亚血平板，并接种所得疑似菌株，于37℃条件下培养24 h后观察并拍照记录。

1.2.3 生化鉴定

生化鉴定使用青岛海博生物有限公司所生产的粪肠球菌生化鉴定管进行生化鉴定。参照其使用说明书对照鉴定结果。

1.2.4 耐受性试验

耐胆盐试验：取复苏菌株0.1 mL，分别接种至已灭菌的含有牛胆盐溶液（0.03、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g/100 mL）的选择培养基中，37℃、无氧条件下培养24 h，24 h后使用平板稀释计数法记录细菌存活数并以不加胆盐培养的细菌活菌数为指标计算各胆盐浓度下细菌的活菌率。计算公式如下：细菌存活率（%）=（不同胆盐浓度下的细菌存活数/空白对照组细菌存活数）×100。

胰蛋白酶的耐受性试验：将复苏细菌离心以收集菌体，用粪肠球菌液体培养基重悬至108CFU/mL，加入0.5%、1.0%、1.3%、1.6%、1.9%不同浓度的胰蛋白酶溶液中，37℃无氧条件下培养24 h；24 h后使用平板稀释计数法记录细菌存活数，并计算细菌存活率，计算公式如下：细菌存活率（%）=（不同胰蛋白酶浓度下的细菌存活数/108CFU/mL）×100。

耐酸试验：将复苏细菌离心以收集菌体，将灭菌后的粪肠球菌液体培养基pH调成(4.3、5.2、6.5、8.2和8.7)，37℃培养1 h后涂布于粪肠球菌琼脂培养基于37℃无氧条件下继续培养10 h，记录生长状况。

1.2.5 体外抑菌试验

在基础培养基中分别涂布20μL大肠杆菌O111、O78标准株、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌，后将已灭菌的牛津杯置于各培养基表面。最后抽取粪肠球菌纯化液200μL转移至牛津杯内，37℃恒温条件下培养24 h，测量其抑菌圈直径。

1.2.6 分子生物学鉴定

PCR凝胶电泳试验：选取耐受性及抑菌效果最好的一株分离菌使用EZUP DNA抽提取试剂盒提取纯化菌株DNA并利用引物对DNA模板进行扩增。PCR反应体系为50μL，模板DNA（20～50 ng/μL）0.5μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5μL，Dntp(各2.5 mmoL/L)1μL，酶0.2μL；F(10 Um)0.5μL，R(10 Um)0.2μL，ddH2O 25μL。热循环仪中，反应按94℃预变性4 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min，4℃终止反应。

配置1.7%的凝胶块，使用PCR扩增产物用于琼脂糖凝胶电泳检测。将上述所得疑似粪肠球菌菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行16SrDNA测序。

16SrDNA系统发育树的构建及同源性分析：利用BLAST网站、Gen Bank数据库对所得测序结果进行同源性分析，运用MEGA 7软件进行发育树的构建及同源性分析。

1.2.7 动物回归试验

将4头犊牦牛随机分为2组，第一组标记为1、2号，第二组标记为3、4号，并分别使用大肠杆菌O111、O78标准株以含量为1×1010CFU/mL[10]每日灌服犊牦牛3次攻毒，灌服5～7日，直至出现典型的腹泻症状后，使用含量为1×1010CFU/mL的粪肠球菌进行灌服治疗，观察并记录犊牦牛临床症状。

2 结果与分析

2.1 菌株活化

分离株S-5成功活化，该活化浓度为6.65×1010CFU/mL。

2.2 形态学鉴定及溶血性分析结果

由图1～图3可知，该分离株在普通粪肠球菌固体培养基上该菌落呈圆形、白色，菌落表面湿润有光泽，其革兰氏染色100×油镜镜检呈紫色阳性球菌，菌落直径为1.28～2.21μm，见图1、图2。将5株菌株接种于哥伦比亚血平板，菌落呈圆形、白色，菌落表面湿润有光泽，S-5无明显溶血环，但其菌落周围变为黑色。

图1 基础固体培养基

图2 革兰氏100×油镜

图3 哥伦比亚血平板

2.3 生化鉴定（见表1）

由表1可知，在生化鉴定中，分离株S-5革兰氏染色呈阳性，能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖等、产酸不产气，不能分解甘露醇、棉籽糖，在硫化氢、硝酸盐、吲哚试验中呈阴性，且血凝试验中不发生凝血反应，见表1。

2.4 耐受性试验

2.4.1 耐胆盐试验（见表2）

由表2可知，在耐胆盐试验中，S-5菌株随胆盐浓度上升存活率不断下降，经F检验分析显示，当胆盐浓度为0.03～0.15 g/100 mL时，分离株S-5耐受性呈显著(P＜0.05)差异，当胆盐浓度为0.20～0.30 g/100 mL时，分离株S-5耐受性呈极显著(P＜0.01)差异。

表1 分离株生理生化鉴定结果

表2 分离株在不同浓度的牛胆盐溶液中的存活率（%）

2.4.2 耐胰蛋白酶液的试验（见表3）

由表3可知，当胰蛋白酶浓度为0.5%～1.3%时，S-5耐受性具佳，经F检验分析显示呈极显著性(P＜0.01)差异；当胰蛋白酶浓度为1.6%～1.9%时，S-5耐受性较佳，经F检验分析显示呈显著性(P＜0.05)差异。2.4.3 耐酸试验（见图4）

表3 分离株在不同浓度的胰蛋白酶液下的存活率（%）

图4 S-5在不同pH培养基中的生长情况

由图4可知，S-5在pH为4.3、5.2、6.5时生长性能具佳。

2.5 体外抑菌试验（见图5和表4）

图5 部分体外抑菌试验结果

由图5、表4可知，体外抑菌试验证明，粪肠球菌S-5对大肠杆菌O111、O78皆有较好的抑菌效果，抑菌圈平均直径分别为(17.00±1.00)、(20.00±1.00)mm；经F检验分析数据表明，粪肠球菌S-5对大肠杆菌O111、O78抑菌效果呈显著性（P＜0.05）差异；对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌皆无抑菌性，呈极显著性（P＜0.01）差异。

表4 抑菌试验结果（mm）

2.6 分子生物学鉴定

2.6.1 PCR凝胶电泳试验（见图6）

图6可知，本次凝胶电泳所使用的为细菌鉴定通用引物，长度为1 500 bp左右，分离株S-5在凝胶成像分析仪上观察位置，目的条带处于Marker的1 500 bp左右，符合预期设定。

2.6.2 16S rDNA系统发育树的构建及同源性分析（见图7、图8）

由图7、图8可知，经16SrDNA测序后利用NCBI在线软件对16SrDNA序列进行BLAST同源性比对，结果显示该分离株S-5 16S测序长度为1 427 bp，经同源性对比知其与粪肠球菌gp117、M-26染色体基因组有98.8%的相似；与粪肠球菌TBT2 SRLFDA 2016染色体基因组有98.3%的相似，即确定该分离株S-5为粪肠球菌菌属，见图7。经计算，本试验所得S-5序列与Gen Bank数据库中已知杆菌属序列的种内遗传距离为0，分离株S-5与粪肠球菌KM495947.1、KY348704.1划为同一分支。

图6 S-5凝胶电泳图（1.7%）

图7 S-5菌株同源性比对分析

2.7 动物回归试验

攻毒第一日，4头牦牛均正常；攻毒第二日，1、3、4号牦牛正常，2号有初期腹泻表现；攻毒第3 d，4头犊牦牛均出现水样腹泻症状；攻毒第4日，4头犊牦牛依旧呈水样腹泻症状；攻毒第五日，4头犊牦牛稳定在水样腹泻状态，并于攻毒第五日开始转用粪肠球菌进行治疗试验。

治疗第一日，4头牦牛未见恢复；治疗第二日，4头犊牦牛腹泻症状逐渐变得良好；治疗第三日，4头犊牦牛腹泻症状逐渐接近健康；治疗第四日，4头犊牦牛腹泻症状已完全消失。

3 讨论

牦牛源粪肠球菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，属于乳酸菌属[4]，是乳酸菌属中为数不多的条件致病菌[11]。与常见只具备益生功能的乳酸菌不同，粪肠球菌可能同时具备“益生功能[12]”及“致病功能[13-14]”两种。前者主要体现为调节机体肠道功能、治疗肠道疾病、增加机体免疫力[15-16]等；后者主要体现在其可感染动物机体的泌尿道、生殖道、口腔、手术伤口等[17]。

图8 S-5菌株与参考菌种16S rDNA基因序列系统进化树

因此，本次分离疑似粪肠球菌菌株S-5首先进行安全性测评，利用哥伦比亚血平板检测其是否有溶血功能，结果显示S-5菌株不具备溶血性，因此不会引起菌血症、败血症等疾病；生化试验中甘露醇试验、血凝试验结果皆呈阴性，表明其不致病，对比鲁旭等[18]的试验结果，S-5菌株与其生化结果相似，侧面验证本试验中粪肠球菌不具备致病功能。经耐胆盐、耐胰蛋白酶液及耐酸试验表明S-5菌株耐受效果良好，其中S-5菌株随其胆盐浓度上升存活率不断下降，在不同浓度的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶浓度为0.5%～1.3%时，S-5耐受性具佳，胰蛋白酶浓度为1.3%～1.9%时，S-5耐受性较佳；耐酸试验中，pH值较低的情况下（4.3、5.2、6.5）S-5菌株生长性能未受太大影响，综上所述表明S-5菌株能适应胃部的复杂环境而进入肠道定植。体外抑菌试验结果表明S-5菌株对大肠杆菌类菌株具有良好的抑制效果，但对葡萄球菌类菌株表现不佳，与陈春艳等[19]所分离的粪肠球菌HEWA223、HEW-A503和HEW-A219对大肠杆菌的抑菌效果相似；最后对S-5菌株提取DNA进行16SrDNA测序分析，在凝胶电泳试验过程中，所使用的为粪肠球菌鉴定通用引物，长度为1 500 bp左右，该分离株S-5在凝胶成像分析仪上观察位置，目的条带处于Marker的1 500 bp左右，符合预期设定，初步断定其为粪肠球菌属，在同源性对比试验中，S-5菌株与粪肠球gp117、M-26染色体基因组98.8%的相似；与粪肠球菌TBT2 SRLFDA 2016染色体基因组98.3%的相似，且在系统发育树上与粪肠球菌KM495947.1、KY348704.1划为同一分支，其中粪肠球菌KM495947.1是Partovi等[20]于2014年在伊朗地区从奶酪中分离得到的肠道益生菌群，粪肠球菌KY348704.1是Khodaei等[21]于2017在伊朗地区从牛奶中分离得到的益生菌群，因此确定该分离株为益生性粪肠球菌。动物回归试验显示分离株对大肠杆菌所导致的犊牦牛腹泻疾病具有良好的治疗效果，对牦牛并未造成致病作用，与Zyl等[22]的对粪肠球菌的评论一致，符合预期效果。

4 结论

综上所述，本次分离的粪肠球菌对大肠杆菌所致的犊牦牛腹泻疾病具有较强的防治功能，为防治犊牦牛腹泻疾病所用益生菌制剂提供重要的参考菌源，也为防治犊牦牛腹泻性疾病提供新思路。