日粮中添加亚硒酸钠对绵羊精液品质、线粒体活性和葡萄糖转运蛋白的影响

■靳天宇 牛宏泽 胡 宇 任有蛇 石 磊

（山西农业大学动物科学学院，山西太谷030801）

硒（Se）是人和动物体所必需的微量元素之一，主要经胃肠道吸收后广泛分布于体内各处，参与动物体内各种代谢反应，具有抗氧化应激、增强免疫力、保护心血管的作用[1]。除此之外，硒与雄性动物繁殖机能，尤其是精子的产生也有着密切联系[2]。Song等[3]研究表明，硒能通过调节细胞凋亡关键基因的表达量来调节生精细胞的增殖与凋亡。睾丸和附睾中高浓度的硒通过参与合成各种硒蛋白，直接参与睾酮的合成以及精子的发生。而缺硒不但会引发各种疾病，还会严重影响动物的生长性能，导致精子质量变差，造成繁殖能力的下降[4]。金海峰等[5]研究表明，在羔羊日粮中添加纳米硒能显著提高精子的顶体完整率，增强精浆中抗氧化酶的活性，从而提高精液品质；闫治川等[6]则发现，在养殖过程中补硒，能显著提高波尔山羊的血清硒含量，精子活力也有显著性提高；施力光等[7]研究发现，日粮中添加0.5 mg/kg酵母硒，能显著提高海南黑山羊的精子密度和精子活力，这充分说明了硒对精子的产生和精液的品质具有十分重要的调节作用。

线粒体是精子最重要的细胞器，位于精子中段，通过复杂的氧化磷酸化生成ATP为精子供能。在线粒体呼吸氧化过程中，电子经过呼吸链的传递，在内膜两侧造成了其他离子浓度的传递，从而形成了线粒体膜电位，膜电位的高低决定着线粒体的活性，也与精子活力与受精能力密切相关。但一直以来线粒体在精子生理和病理中的作用却被忽视。最近的研究指出，线粒体正常的能量代谢是支持精子多种功能的关键因素[8]，而葡萄糖和果糖是其主要的代谢底物和燃料分子。葡萄糖转运蛋白(GLUTs)是一类调控胞外葡萄糖进入胞内的跨膜蛋白，参与精子能量代谢，在调节精子能量代谢过程中发挥着关键作用[9]。已知的GLUTs由500个左右的氨基酸残基组成[10]，其结构共有14种。GLUTs家族中大部分蛋白都可以转运葡萄糖，已有研究报道，一些糖转运蛋白如GLUT 3、GLUT 8的分布和表达与精子活力和线粒体功能有关[11]。因此，本试验通过在绵羊日粮中添加适宜水平的亚硒酸钠，研究硒对绵羊精液品质的影响，并通过检测精子的线粒体活性和GLUT 3、GLUT 8蛋白的表达丰度探究硒是否通过调节精子能量代谢影响精子活力。

1 材料与方法

1.1 试验设计与日粮组成

试验在山西省太谷县保森畜牧有限公司的养殖场内进行。选取24只（3±0.5）岁，体重相近（38.5±7.5）kg的成年杜泊公羊，随机分成2组。对照组饲喂基础日粮（对照组），试验组饲喂基础日粮+0.5 mg/kg亚硒酸钠的日粮（硒处理组）。基础日粮按照NRC（1985）山羊饲养标准的营养水平设计配方，由苜蓿干草、秸秆和精饲料（玉米、豆粕等）组成，日粮组成及营养水平见表1。试验用羊单栏饲养，每日8：00与16：00各饲喂一次，自由饮水。试验期90 d，预试期15 d，正试期75 d。

表1 日粮组成及营养水平（干物质基础）

1.2 样品采集

饲养试验结束前两周，使用假阴道法每周采精2次（隔2 d采精）。采集精液后用保温箱带回实验室，取少量样品检测精子活力、精子直线运动速度（Velocity of Straight-line，VSL）、精子曲线运动速度（Velocity of Curvilinear，VCL）、精子平均运动速度（Velocity of Av⁃erage path，VAP）、精子质膜完整性和线粒体完整性，剩余样品2 200 r/min离心10 min，保留沉淀用于GLUTs的丰度检测与免疫荧光试验。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 精子活力与运动参数

采集精液后立即进行精子品质检测，使用预热的磷酸盐缓冲液（PBS）调节精子浓度至6.0×107个/mL，取精液10μL滴在预热的载玻片上观察，通过计算机辅助精子分析系统（CASA）分析精子活力与运动参数。

1.3.2 精子质膜完整性

通过低渗肿胀法（HOST）检测精子质膜是否完整。低渗溶液由1.35 g果糖和0.735 g柠檬酸钠加入100 mL纯化水中配制而成。将精液样品放入37℃水浴锅中孵育3 min，吸取10μL精液加入提前预热好的离心管中，再加入100μL预热好的低渗溶液，水浴锅中孵育30 min。取10μL混合液涂片，风干后于400×显微镜下观察，随机计数500个以上精子。质膜完整率（%）=质膜完整的精子/总精子数×100。

1.3.3 精子的线粒体活性检测

线粒体活性用线粒体膜电位表示，通过JC-1与PI双荧光染色法进行检测。从样品中吸取80μL精液加入提前预热好的离心管中后，加入4μL JC-1以及2μL PI染液。避光条件下孵育30 min，然后加入总体积10%的Hancock’s solution溶液，吹打混匀后取3.5μL的混合液于载玻片上，压片后在400×荧光显微镜下观察，随机计数500个以上精子。JC-1/PI荧光染色的结果为：尾部呈橙色荧光的精子为高线粒体膜电位精子；尾部呈绿色荧光的精子为低线粒体膜电位精子。精子线粒体活性（%）=高线粒体活性的精子/精子总数×100。

1.3.4 GLUTs的表达检测

将对照组与硒处理组样品用生理盐水2 000 r/min离心清洗3次，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂(PMSF)置于冰上裂解30 min，超声波破碎，4℃、13 000 r/min条件下离心15 min，保留上清蛋白溶液。使用核酸蛋白仪测定蛋白浓度。采用常规Western Blot方法测定提取蛋白样品中GLUTs的表达量水平。取保存的蛋白每管加入20μL样品缓冲液（精子蛋白∶蛋白样品缓冲液=4∶1），在100℃条件下变性10 min，每个样品的总蛋白上样量为50μg。经SDS-PAGE凝胶电泳转至NC膜，使用5%的山羊血清室温封闭1 h，分别加入GLUT3、GLUT8（1∶500）和β-actin（1∶10 000）一抗，4℃孵育过夜。用Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)洗膜3次，每次10 min。加入荧光二抗，避光孵育1 h后，TBST漂洗3次，每次10 min。用Odyssey®CLX双色近红外成像系统拍照。使用Image J图像分析软件扫描测定灰度值，重复三次。GLUTs相对丰度=GLUTs灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.3.5 免疫荧光检测GLUTs定位

取适量精液涂抹于黏附性载玻片上自然风干，4%多聚甲醛固定20 min，用磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5 min，自然风干。样品处滴加5%山羊血清封闭3 min，PBS清洗3次，每次5 min；滴加一抗（1∶150）于4℃湿盒中孵育过夜，PBS清洗3次；样品处滴加FITC荧光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，封片并在荧光显微镜下观察拍照，每张涂片随机选取5个视野。

1.4 数据分析

试验所得数据均以“平均值±标准误”来表示，用SPSS 22.0统计软件的one-way ANOVA方差分析，用LSD法进行多重比较。每个处理3个重复，差异显著性水平为P＜0.05。用GraphPad Prism 6.0软件做图。

2 结果与分析

2.1 日粮中添加硒对绵羊精液品质的影响（见表2）

表2 日粮中添加硒对绵羊精子活力、运动参数的影响

由表2可知，硒处理组绵羊精子的活力和活率均显著高于对照组（P＜0.05）。经由CASA系统分析后，发现硒处理组精子的VSL、VCL与VAP都显著高于对照组（P＜0.05）。表明日粮中添加硒能显著增加绵羊精液的活力与活率，且显著提高了精子运动速度。

2.2 日粮中添加硒对绵羊精子质膜完整性及线粒体活性的影响（见图1）

由图1可知，硒处理组的质膜完整性以及线粒体活性均高于对照组，且差异显著（P＜0.05）。表明日粮中添加硒有助于提高精子的质膜完整性，也有利于增强精子线粒体的活性。

2.3 日粮中添加硒对绵羊精子GLUTs表达的影响

通过Western Blot分析对照组与硒处理组绵羊精子中GLUT3、GLUT8蛋白的相对表达丰度（见图2），结果可知，硒处理组与对照组相比，GLUT3、GLUT8蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。

图1 日粮中添加亚硒酸钠对绵羊精子质膜完整性（a）及线粒体活性(b)的影响

图2 日粮中添加硒对绵羊精子GLUTs表达的影响

2.4 绵羊精子GLUTs的定位

免疫荧光检测结果如图3所示，GLUT3与GLUT8两种蛋白表达位置不同。GLUT3的阳性区域主要在精子的头部、精子中段及尾段；GLUT8蛋白主要定位于精子顶体、头部以及精子中段。

3 讨论

图3 绵羊精子GLUT3、GLUT8蛋白的定位

硒对动物精液品质提高的研究已经日趋完善，缺硒动物日粮中添加硒元素能提高动物的精液品质。金海峰等[5]研究发现，日粮添加硒能提高羔羊的精子活力。王海娜等[12]研究发现日粮添加有机硒，可不同程度地提高小鼠精子的质量。然而，不同种类动物中硒的添加量不同，而且由于不同地域硒水平不同，硒的添加效果差异很大。根据课题组多年的研究，初步确定了山西绵羊和山羊日粮中硒的适宜添加量[13-15]。本试验公羊日粮中亚硒酸钠的添加量为0.5 mg/kg。结果发现，硒处理组的公羊精子活力有了显著提高。此外，本试验还通过CASA系统分析了精子的运动参数，发现与对照组相比，硒处理组的精子的VSL、VCL与VAP都显著提高，表明硒的添加有效地提高了精子的运动能力。硒提高动物精子运动能力的原因可能是多方面的。首先，雄性动物的精子发生主要依赖于睾酮，硒通过促进间质细胞睾酮的合成为正常的精子发生和精子运动提供适宜的内分泌环境[16]；其次，硒作为一种抗氧化剂可以提高机体和精清的抗氧化酶活性[14]，减少了氧自由基对精子线粒体和膜结构的损伤，保障精子尾部结构和功能的完整性，从而维持精子正常的结构和运动能力。而本试验中对照组与硒处理组精子质量差异显著，可能的原因是山西地处我国严重缺硒地区，饲草料中的硒严重不足，因此在日粮中添加硒可以增强精子品质的效果异常显著。精子质量是评价公畜繁殖性能的重要指标，精子活力则是精子质量评估中最基本，也是最重要的指标之一，它最直观地反映了精子的受精能力[17]，只有高活力的精子才能经由直线运动完成受精过程。虽然在公畜日粮中添加硒元素能有效提高精液品质，但需要根据该区域的硒状况确定适宜的添硒量。

线粒体是能量代谢中最重要的细胞器，主要分布于精子的中段和尾段，它的功能是否正常直接决定了精子的活力和运动参数，尤其是精子的直线前进的能力。白修云等[18]研究表明，线粒体活性低的精子不具备受精的功能。而硒在精子中主要分布于精子头部以及中段的线粒体膜中，可以选择性地结合于精子尾部中段，缺硒会造成精子中段的膜结构破裂，轴丝外露，从而导致精子线粒体活性异常，造成精子的活力下降[19]；张明等[20]研究表明，低硒可降低大鼠心肌线粒体的活性,使心肌细胞损伤；高良才等[21]则发现，硒能拮抗氧自由基引起的线粒体活性异常。在本研究中，日粮中添加0.5 mg/kg的硒不但提高了线粒体的活性，而且保护了精子质膜结构的完整性，与上述研究结果一致。说明硒的添加有效地提高了线粒体的活性，还保护了精子质膜的完整性，使精子保持正常的结构功能，从而提高了精子质量，这也是硒处理组精子活力更高的原因。

GLUTs是精子能量代谢相关蛋白，主要负责糖类的摄取，其表达量高低直接影响精子从环境中摄取糖类的效率，进而影响到精子活力与线粒体活性[22-23]。本研究采用Western Blot与免疫荧光方法分别确定硒处理组与对照组GLUT3、GLUT8的表达量差异与阳性定位。结果显示，GLUT3主要表达于精子的头部、精子中段及尾段，且硒处理组的GLUT3蛋白表达量显著高于对照组，这可能是由于活性氧（Reactive oxygen species，ROS）会与精子质膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，造成精子质膜受损，从而导致膜结构蛋白的重新定位与丢失，造成GLUT3的表达下降，而硒处理组提高了精子的质膜完整性，从而导致其表达量高于对照组。GLUT8蛋白的阳性区域主要存在于精子顶体、头部以及精子中段线粒体密集部位。硒处理组的表达量显著高于对照组，推测可能是由于GLUT8主要位于精子顶体和线粒体密集部位，随着精子代谢产生ROS导致精子线粒体膜发生脂质过氧化反应，促使线粒体膜通透性改变，最终导致线粒体肿胀，外膜涨破，从而造成GLUT8蛋白表达下降，而对照组线粒体活性更低，也印证了这个观点，这与Sancho等[24]的研究结果相似。在本研究中，GLUT3、GLUT8蛋白的表达量与精子的质量成正比，且都广泛地存在于线粒体密集部位，推测可能是GLUT3、GLUT8蛋白与精子线粒体的能源供应密切相关，GLUT3、GLUT8蛋白的丰度变化可能直接导致精子细胞能量供应不足或营养利用能力下降，这也可能是精子活力和运动参数下降的主要原因。Gawlik等[25]发现，敲除SLC2A8的小鼠不仅精子活力下降了50%，其线粒体膜电位和精子细胞中ATP水平也表现出不同程度的降低，这也与本试验结果一致，印证了上述可能。因此，日粮中添加硒能显著提高GLUT3、GLUT8蛋白的表达，从而有助于增强精子细胞的能量代谢或增加精子细胞的能量供应。同时，GLUTs可能是维持精子活力的最重要的转运体之一，并在精子细胞的能量代谢中发挥重要作用。

4 结论

日粮中添加0.5 mg/kg亚硒酸钠可显著提高精子线粒体活性，保护精子质膜完整性，提高Glut3、Glut8蛋白的表达量，增强精子细胞的能量代谢，从而提高精子的活力与运动参数，改善精液品质。