王法宝 夏泽亮 褚 亮 周少波 许兆龙 蒋 磊 单二波 周超毅
蚌埠医学院第二附属医院,安徽 蚌埠 233000
胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率及病死率均较高。在我国,局部进展期和晚期胃癌占绝大部分,极易复发与转移,预后很差[1-2]。其中,腹膜转移是局部进展期胃癌常见的进展方式,而晚期胃癌也以合并腹膜转移为疾病进展的表现方式[3-4]。针对胃癌伴腹膜转移的病例,目前尚缺乏令人满意的治疗措施。近年来,腹腔热灌注化疗(hyperthermic intraperitoneal chemotherapy,HIPEC)在临床上得以应用,它是将含有化疗药物的灌注液注入腹腔,辅以灌注机维持恒温、循环灌注,并使灌注液充盈腹腔达一定时间,以达到预防和治疗腹膜癌、腹腔肿瘤、恶性腹水的目的[5-6]。但HIPEC治疗胃癌伴腹膜转移的临床疗效尚不明确,其作用机制亦缺乏实验数据支持。由于顺铂具有抗瘤谱广及抗癌活性高的优点,且可兼顾静脉给药和胸、腹腔给药两种途径,是临床上常用的HIPEC药物之一。本课题拟通过建立胃癌细胞体外作用模型来观察热灌注化疗对胃癌细胞的形态、凋亡比率以及胃癌细胞凋亡相关基因表达的影响,以探究腹腔热灌注化疗对胃癌细胞的影响及其可能的分子机制,以期为临床上HIPEC治疗胃癌伴腹膜转移提供理论和实验支持。
SGC-7901细胞株(中乔新舟有限公司,货号:ZQ0062)。
试剂:细胞培养基,购自中杉金桥有限公司,货号:A02;胎牛血清,购自Gibco公司,货号:10099-141;Hoechst染色试剂盒,购自碧云天公司,货号:C0057;CCK-8试剂盒,购自碧云天公司,货号:C1245;Caspase-3一抗,购自Cell Signaling Technology,货号:9662;Bcl-2一抗,购自Cell Signaling Technology,货号:15071;Bax一抗,购自Cell Signaling Technology,货号:5023;Bid一抗,购自Cell Signaling Technology,货号:8762;β-actin一抗,购自碧云天公司,货号:C1035;仪器:流式细胞仪,购自美国贝克曼库尔特公司;倒置荧光显微镜,购自奥林巴斯;高速冷冻离心机,购自贝克曼;转膜仪,购自BIO-RAD。
将SGC-7091细胞置于完全培养基内培养(10%胎牛血清),培养条件为:5%CO2,37 ℃,间隔2~3 d进行细胞传代。将传代的SGC-7091细胞调整密度为5×105个/mL,取100 μL细胞接种于96孔板内培养。将细胞分为对照组、顺铂组、热疗组以及热化疗组,其中顺铂组:处理浓度为100 μg/L,热疗组:43 ℃,90 min;热化疗组:顺铂(100 μg/L),43 ℃,90 min。
根据1.3实验方法学的分组处理,96孔板设置6组复孔,共3批次进行细胞活力实验。酶标仪设置检测波长450 nm检测各组细胞的吸光度值(OD),细胞活力(OD)=实验组细胞OD值-阴性对照组OD值。
按照试剂盒操作说明书进行。
培养结束后收集细胞上清液;PBS洗2次,消化并收集细胞,与上清液混合;2000 r/min 离心5 min,PBS洗2次,各组加入400 μL Annexin-V结合液,重悬细胞;每组加入Annexin-V-EGFP染色液 5 μL,在4 ℃条件下避光孵育15 min,加入10 μL PI,在4 ℃下避光孵育5 min,流式细胞仪检测细胞凋亡比率。
将处理完毕的SGC-7901细胞清洗后放置于研磨管内,按照合适的比例加入细胞裂解液放置于冰上裂解40 min,期间每间隔5 min进行细胞涡旋振荡保证裂解完全,将裂解后的离心管放置于离心机内,4 ℃,12 000 r/min离心10 min,得到细胞上清液。BCA法测定蛋白质浓度,上样,电泳,转膜,孵育Caspase-3一抗(1∶1000),Bax一抗(1∶1000)、Bid一抗(1∶1000)和Bcl-2一抗(1∶1000),于4℃过夜,洗膜,孵育对应的二抗,室温孵育60 min,TBST洗膜5 min×3次,加入显影液,显影并拍照,最后采用Image J软件分析相关蛋白灰度值。
通过CCK-8检测各组细胞活力发现,与对照组相比,其余3组细胞活力均显著降低(P<0.01);与顺铂组相比,热疗组差异无统计学意义(P>0.05),热化疗组活力显著降低(P<0.05),见表1。
表1 各组细胞活力比较
通过Hoechst染色检测显示,与对照组相比,其余3组细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01);与顺铂组相比,热疗组差异无统计学意义(P>0.05),热化疗组细胞凋亡率显著升高(P<0.05);见图1、表2。流式细胞仪检测显示,与对照组相比,其余3组细胞凋亡率亦显著升高(P<0.01);与顺铂组相比,热疗组差异无统计学意义(P>0.05),热化疗组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);见图2、表3。
图1 Hoechst染色观察SGC-7901细胞凋亡情况(×400)(A为对照组;B为顺铂组;C为热疗组;D为热化疗组)
表2 Hoechst染色检测各组细胞凋亡情况
表3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率的比较
图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况(A为对照组;B为顺铂组;C为热疗组;D为热化疗组)
2.3热化疗对SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达的影响
Western blot检测SGC-7901细胞凋亡相关蛋白表达水平,结果显示,与对照组相比,其余3组Caspase-3、Bax和Bid表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),Bcl-2表达显著降低(P<0.05或P<0.01);与顺铂组相比,热疗组相关蛋白表达差异无统计学意义,热化疗组Bax表达显著升高(P<0.05)。见图3。
A.Western blot条带;B.蛋白相对表达量。与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与顺铂组相比,#P<0.05。
HIPEC是以精准控温为核心,集化疗、热疗、机械冲洗为一体的独特治疗手段,将含化疗药物的灌注液精准恒温、循环灌注、充盈腹腔并维持一定时间,可以达到防治肿瘤腹膜种植转移的目的[7]。研究表明,HIPEC杀死和抑制腹腔内癌细胞主要机制涉及增加化疗药物与腹腔内癌细胞的接触概率,提高化疗药物的杀伤力。另外,热效应可以抑制肿瘤的DNA复制、转录、修复,从而起到杀死肿瘤细胞的作用。但是,目前国内外关于HIPEC的研究以临床研究为主,有关HIPEC对体外肿瘤细胞的杀伤作用研究较少。因此,本课题通过体外探究HIPEC对胃癌细胞系SGC-7901的作用,进而为临床HIPEC治疗提供可靠依据。
本研究首先通过对SGC-7901细胞进行细胞活力实验,结果显示,与对照组相比,顺铂组、热疗组和热化疗组细胞活力显著降低;与顺铂组相比,热化疗组细胞活力显著降低。以上研究初步证实,热化疗能够更加显著的抑制SGC-7901细胞的增殖。细胞凋亡与增殖的失衡是肿瘤过度生长的主要原因[8],为此,实验进一步探究HIPEC对细胞凋亡的影响。结果发现,与对照组相比,顺铂组、热疗组和热化疗组细胞凋亡率均显著升高;与顺铂组相比,热化疗组细胞凋亡率显著升高。Caspase-3、Bax、Bid和Bcl-2是调节细胞凋亡的关键蛋白[9]。与正常细胞株相比,胃癌细胞株Caspase-3、Bax、Bid表达显著降低,Bcl-2表达显著升高[10]。本研究发现,与对照组相比,顺铂组、热疗组和热化疗组Caspase-3、Bax、Bid均显著升高,Bcl-2表达显著降低;与顺铂组相比,热化疗组Bax表达显著升高。
综上所述,顺铂腹腔热灌注化疗能够通过促进Caspase-3、Bax和Bid表达,下调Bcl-2,促进SGC-7901细胞凋亡。以上研究结果将进一步为HIPEC治疗胃癌伴腹膜转移的机制提供实验依据,为胃癌持续HIPEC的临床推广应用提供理论和实验支持。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突