内生真菌LZY9固体发酵丹参茎叶产纤维素酶的工艺条件优化*

王永迪 邱孟娇 张晓华 汪 鑫 张志浩 李艳玲 常正尧

山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学学院，山东 泰安 271016

纤维素酶(cellulase)最早由Seilliere发现于蜗牛的消化液中[1]，其主要用途为可以将纤维素降解为葡萄糖，是一种复合酶[2]。纤维素酶种类多，来源广，自然界中细菌、真菌以及大多数生物体内都能产生纤维素酶。在能产纤维素的生物体内，真菌纤维素酶的产量高、活性大，因此，真菌成了生产纤维素酶的主要菌种来源。

丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎[3]，作为重要的中药材，因其根茎中含丹参酮类化合物，常被用于心脑血管疾病的治疗[4-5]。除此之外丹参对于活血、调经、祛瘀、安神、消痛等亦有良好功效[6]，可用于胸肋疼痛、月经不调、斑疹、心悸、失眠等病症。全国大部分地区都有分布，见于荒地、路旁或山坡。在前期工作中，课题组从泰山丹参中分离得到多株能够产纤维素酶的内生真菌，其中筛选发现了一株产纤维素酶活性高的内生真菌菌株LZY9。

响应面法(response surface methodology, RSM)是综合数学与统计的方法与知识，将经验模型与试验设计相关的试验数据拟合方程[7]，对多个变量进行建模和分析[8-9，其所需试验次数少，周期短，且精密度高，能表示几种因素间的交互作用的强弱[10-11]。RSM在生物学领域应用比较广泛，主要用于研究各化学成分所占比例与生物活性之间的关系，确定最佳试验条件，现已广泛用于发酵过程优化[12-15]。本研究旨在对内生真菌LZY9产纤维素酶的工艺条件进行优化，其研究结果为纤维素酶的生产提供了一条途径，也为中草药地上资源的废物利用提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种 丹参内生真菌LZY9：由山东第一医科大学李艳玲老师提供。

1.1.2PDA培养基 马铃薯200 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂15.0 g，水1000 mL，自然pH值。

1.1.3固体培养基 除特殊说明外，本试验所用组成为:取5.0 g经过60目筛的丹参茎叶粉末，加入一定量的去离子水，自然pH值，在121 ℃进行灭菌处理30 min，冷却备用，用于固态发酵生产纤维素酶试验。本试验所用丹参茎叶粉末来自莱芜白花丹参种植基地，经自然风干、烘干、粉碎、过筛后，置于干燥器中备用。

1.2 方法

1.2.1丹参内生真菌的分离纯化 以新鲜健康的丹参为材料，用自来水清洗样品的根、茎、叶, 在无菌条件下，依次以75%乙醇消毒2 min，次氯酸钠溶液消毒5 min，用无菌水冲洗3遍,上述过程处理完毕后，在无菌条件下使用剪刀切去其表层组织，将中间部分切成约0.5 cm×0.5 cm大小，用于PDA抗生素(青霉素)培养基的接种，培养室温度28 ℃，观察材料边缘有菌落长出。

1.2.2纤维素酶产生菌的初筛 待培养基中长出菌落，加入刚果红溶液(1 mg/mL)使其覆盖在表面上，10～15 min后，舍去刚果红溶液，再添加NaCl溶液(1 mol/L)，15 min后倒掉。此时，在产生纤维素酶的菌落周围出现有透明圈。

1.2.3真菌LZY9液体发酵培养 取试管冷冻保藏的菌株，接种至PDA固体培养基，待其复苏长出后，取5 mm的菌饼接种至250 mL锥形瓶中，每个锥形瓶中装100 mL PDA液体培养基，摇床28 ℃培养3 d，制备种子液。

1.2.4真菌LZY9固体发酵 将丹参地上茎叶粉碎，分别过60目筛，称取5.0 g过筛药渣，加入7.5 mL水，封口膜封瓶，浸泡12 h，灭菌。接入20%的菌种LZY9的孢子菌悬液，28 ℃培养7 d。

1.2.5〗粗酶液的制备 将固态发酵物放置50 ℃烘干箱烘干1～2 d直至干重，然后用研钵将发酵物研成粉末。每个发酵物粉末称取1 g放入25 mL离心管中，加入25 mL pH 4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液,放入水浴超声清洗仪中40 ℃超声提取1 h，提取过程中每隔15 min震荡1次，之后采用4层纱布过滤的方法，以8000 r/min离心10 min。离心后取上清，此上清液即粗酶液。将粗酶液放置冰箱4 ℃备用。

1.2.6CMC酶活力测定 以0.2 mol/L pH=4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液和5%羧甲基纤维素钠溶液各2.0 mL为底物，粗酶液0.5 mL，依次加入到比色管中，用50 ℃保温30 min。上述3种液体加入完毕，再加入2.5 mL DNS试剂，沸水浴5 min，进行发色反应,所得液体经冷却定容后，测出其吸光度。然后与空白对照做对比。根据葡萄糖标准方程测得还原糖浓度。根据酶活力大小选出酶活力最大的菌种。

1.2.7固体发酵条件优化 称取5.0 g丹参茎叶粉末，通过响应面法优化LZY9产纤维素酶的培养条件。选取含水量、接菌量、培养天数3个因素，每个因素选取3个水平，分别编码(-1，0，+1)，以酶活力为响应值，进行二次回归拟合，因素水平见表1。

1.3 统计学方法

采用 Design Expert 8.0.6软件对含水量、接菌量、培养天数3个因素的响应值进行回归拟合分析，采用SPSS 19.0软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 筛选培养基染色

利用刚果红平板筛选法，共从28株丹参内生真菌中筛选出1株产纤维素酶高活性菌株LZY9，见图1。

图1 内生真菌LZY9产纤维素酶刚果红平板初筛

2.2 响应面法优化发酵培养基

由Box-Behnken试验设计，在单因素试验基础上选取含水量、接菌量、培养天数3个因素进行响应面分析，以丹参地上茎叶产纤维素酶的酶活力为响应值，结果发现，响应面优化得到菌种LZY9固体发酵产纤维素酶的最佳条件为含水量5.0%、接种量60%、培养天数5 d，在此条件下的酶活力为13.417 IU/g。见表2。

表2 Box-Behnken试验方案设计与纤维素酶活力

2.3 方差分析

由表3可知，该模型P<0.01，差异具有统计学意义；回归模型的决定系数R2=0.9845,校正决定系数RAdj2=0.9647,失拟项P>0.05，表明该模型回归有统计学意义，失拟性无统计学意义，因而无失拟因素存在。一次项A，交互项AB、AC，二次项A2、B2、C2对结果影响极显著,3个因素对酶活力的影响作用从大到小依次为：A>B>C。

表3 二次回归模型方差分析

2.4 响应面图分析

图2是纤维素酶活力在不同因素相互影响下的响应面图。等高线的不同可以直观的反映出不同因素交互作用的影响，若形状为圆形，则表示因素交互作用不明显；若形状为椭圆形，则表示因素间交互作用明显[19-21]。通过对3组图的比较可得，含水量与接菌量、含水量与培养天数、接菌量与培养天数的等高线均为椭圆形，反映出3种因素之间交互作用对纤维素酶活力影响明显。三维图形均为开口朝下的凸面，响应面中心点位于变量范围内，说明纤维素酶活力在两种因素交互关系中具有最大值，且随着因素的改变，纤维素酶活力呈现先增加后降低的趋势。

图2 不同因素组之间交互作用对纤维素酶活力的影响

3 讨 论

本研究从丹参叶中分离到一株产纤维素酶的内生真菌菌株LZY9。利用单因素试验和响应面优化的方法，优化了内生真菌LZY9固体发酵丹参茎叶产纤维素酶的最佳培养条件：在含水量5.0%、接种量60%、培养天数5 d的条件下产酶量相对较高。该研究先进行单因素试验，然后再进行响应面优化，分析得出菌种LZY9固体发酵产纤维素酶的最佳培养条件，方法严谨，真实可靠。但总体来看，内生真菌LZY9在丹参茎叶上固体发酵产纤维素酶活力不是特别高，主要原因可能是丹参茎叶中营养物质不能满足内生真菌LZY9，因此仍需进一步研究内生真菌LZY9固体发酵产纤维素的条件。

利用纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖的特性，可以将纤维素酶应用于食品、饲料加工、资源再利用等诸多领域[16]。通过优化固态发酵产纤维素酶的工艺条件，能有效提高纤维素酶活力，提高与纤维素酶应用有关产业的生产效率。对于传统中药来说，利用内生真菌固体发酵地上茎叶废弃物来生产纤维素酶，可进一步实现对中草药资源的再利用，减少中草药资源浪费，也能减少对环境的破坏作用，具有重要的经济和社会价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突