睡眠剥夺后大鼠下丘脑Orexin-A神经元的表达及其对学习记忆的影响*

倪丽艳 唐吉友

1.巨野县人民医院，山东 巨野 274900； 2.山东第一医科大学第一附属医院，山东 济南 250014

睡眠剥夺(sleep deprivation，SD)指由于环境或自身原因导致没有充足睡眠的一种状态，是现代社会的普遍现象。研究表明SD会降低人及实验动物的学习能力并损害记忆[1-3]。然而导致SD损害学习记忆的机制目前尚不完全清楚。Orexin-A是下丘脑外侧区分泌的一种神经肽，Orexin-A的重要作用是调节睡眠/觉醒[4]，睡眠剥夺可激活Orexin神经元[3,5]，正是由于Orexin的发现，失眠的概念由睡眠失调转为过度觉醒[6]。另有研究表明，Orexin-A与学习记忆密切相关[7]。

为进一步探讨下丘脑Orexin-A的变化在睡眠剥夺影响学习记忆中的作用，本研究中使用跑步机剥夺睡眠的方法使大鼠的非快速眼球运动(non-rapid eyes movement，NREM)和快速眼球运动(rapid eyes movement，REM)睡眠减少[8]，观察下丘脑Orexin-A的表达，并利用Morris水迷宫测试各组大鼠学习记忆能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物及分组

健康成年雄性 Wistar大鼠，质量(200±20)g，由山东济南朋悦实验动物有限公司提供。随机分为空白对照(CC)组、环境对照(TC)组、睡眠剥夺(SD)组。大鼠均在12 h光亮/黑暗条件、22～25 ℃环境温度下分笼喂养。

1.1.2主要试剂与仪器

水迷宫设备(北京众实迪创科技发展有限公司)；跑步机(ZH-PT型多功能跑台系统，安徽正华生物仪器设备有限公司)；显微镜(OLYMPUS，日本)。兔抗 Orexin-A多克隆抗体(Cell Signaling Technology，CST)，山羊抗兔IgG二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1睡眠剥夺

采用间歇式跑步机系统对大鼠进行72 h全睡眠剥夺，跑步机的传送带上方0.6 cm处为有机玻璃分隔成大小相等的鼠笼(28 cm×28 cm×40 cm)，笼顶扣上栅栏式鼠笼盖，可放置饲料和水瓶，跑步机的传送带形成鼠笼的底。当大鼠在跑步机上时，可以自由获取食物和水。动物房光照/黑暗周期为12 h∶12 h，光照时间为8:00～20:00，动物房温度22～24℃，湿度60%～70%，避免噪音。跑步机速度设定为10 cm/s。SD组设定运行3 s，停止12 s；TC组设定运行15 min，停止60 min，允许TC组大鼠获得持续的休息时间，但跑步的总距离相等。运行和停止循环进行。

1.2.2Morris水迷宫试验

采用Morris水迷宫(MWM)检测SD后大鼠的空间学习记忆功能。水迷宫装置由一个直径150 cm、深80 cm的圆形水池组成，分为4个大小相等的象限；池内水深40 cm，水温(24±1)℃；水面以上每个象限池壁中心位置处各张贴1个不相同的醒目标记。水面下1 cm隐藏着一个直径10 cm的黑色圆形平台，该平台的位置在整个试验过程中保持不变。

1.2.2.1定位航行试验 测试大鼠对水迷宫的学习能力。根据水池中每个象限的标记，训练大鼠寻找隐藏在水面下的平台。选择每个象限的醒目标记下方为入水点，将大鼠面向池壁放入水中。象限选择是随机的，每个象限都有1次机会。每次实验时，将一只大鼠放入水池中，允许其在水下搜索平台的最长时间为120 s，大鼠发现平台后允许其在平台上停留30 s。如果在120 s内未能找到平台，则将其引至平台，记录其逃避潜伏期为120 s。4个象限的平均逃避潜伏期为大鼠学习能力的每日结果。

1.2.2.2空间搜索试验 测试大鼠对平台空间位置的记忆能力。在训练后第6天进行，测试只进行1次，测试时间为120 s。将隐藏的平台从水迷宫中移走，选平台相对象限为入水点。记录每只大鼠的目标象限停留时间和穿越原平台位置次数。

1.2.3免疫组化

睡眠剥夺后3%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，沿腹中线剪开胸骨，暴露心脏，用16号针头穿刺通过左心室至升主动脉，大弯钳夹住针头固定，再用剪刀剪破右心耳，先用0.9%生理盐水快速冲洗，直至流出的液体为无色透明的澄清液，再灌注含4%多聚甲醛0.1 mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)，断头取脑后在10%中性甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋、切片。组织切片预处理后行抗原修复，3%H2O2去离子水孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗5 min×3次，加兔抗 Orexin-A多克隆抗体 (1∶1000, CST)，4 ℃过夜，PBS冲洗5 min×3次，加生物素标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次，加生物素-卵白素-HRP复合物ABC，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，脱水、透明、封片，脱蜡水化组织切片，甘油封片，显维镜下观察。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠下丘脑Orexin-A阳性神经元表达

2.1.1Orexin-A神经元形态

在光镜下观察到大鼠下丘脑外侧区大量胞质染成棕黑色的细胞,为Orexin-A神经元的阳性表达。SD组大鼠的Orexin-A神经元的细胞大小、着色深度及细胞核大小与 CC组相比未见明显差异，见图1。

图1 下丘脑Orexin-A神经元的表达(A为CC组；B为TC组；C为SD组)

2.1.2下丘脑Orexin-A神经元数量

SD、CC及TC组大鼠下丘脑Orexin-A阳性细胞数分别为623.00±7.54129、426.40±31.16569、457.00±4.73254，SD组较CC及TC组明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)，见图2。

图2 大鼠下丘脑Orexin-A神经元的表达数量比较(与TC和CC组比较，＊P<0.001 )

2.2 Morris水迷宫检测结果

2.2.1定位航行试验结果

SD结束后行水迷宫试验检测各组大鼠的学习能力，随着训练天数增加，各组大鼠的逃避潜伏期逐渐缩短。SD组大鼠同一天的逃避潜伏期与CC组和TC组相比延长，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1，图3。

表1 各组大鼠平均逃避潜伏期比较

图3 各组大鼠平均逃避潜伏期比较(与CC和TC组比较，＊P<0.01)

2.2.2空间搜索试验结果

CC、TC和SD组大鼠穿越平台象限次数分别为(22.0625±2.86284)、(22.1875±2.53558)和(12.8750±2.30579)次，平台所在象限游泳时间分别为(54.5169±3.88937)、(54.3131±3.24989)和(46.3781±4.11376)s， 与TC和CC组相比，SD组穿越平台象限次数和平台所在象限游泳时间减少，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4，5。

图4 各组大鼠穿越平台次数(与CC和TC组比较，＊P<0.01)

图5 各组大鼠平台象限的停留时间(与CC组和TC组比较，＊P<0.01)

3 讨 论

有研究表明，SD导致实验动物学习记忆能力下降，表现为一些行为学任务下降，如Morris水迷宫任务[3]、逃避任务[9]、径向水迷宫任务[10]等。本研究结果表明，在Morris水迷宫测试中，72 h SD的大鼠逃避潜伏期延长，平台穿越次数及目标象限停留时间减少，提示72 h SD损害Morris水迷宫试验中大鼠的空间学习记忆能力。我们的研究结果还表明，72 h SD后大鼠下丘脑外侧区Orexin A分泌增多，同时伴随Morris水迷宫空间学习记忆能力的损害。我们推测下丘脑Orexin A的过度表达可能在睡眠剥夺影响海马依赖性空间学习和记忆中发挥重要作用。

Orexin，又称hypocretin，是由下丘脑外侧区的Orexin前体产生的一种神经肽，包括Orexin A和Orexin B，其中Orexin A的生物活性相对稳定，其通过激活两个G-蛋白耦联受体Orexin-1受体(OX1)和 Orexin-2受体(OX2)发挥其生物学作用[11]。近年来研究表明，Orexin及其受体不仅参与睡眠/觉醒状态的调节[12-13]，还与学习记忆密切相关[14-17]。Orexin在调节睡眠和觉醒中的作用的研究较多，有研究显示Orexin缺乏可导致猝倒型发作性睡病(以过度嗜睡、睡眠发作、猝倒发作和睡眠片段化为主要表现)[18]。另有研究发现患者维持觉醒状态时Orexin神经元放电，睡眠时(包括NREM和REM期)停止放电[19]。REM期SD激活Orexin神经元，导致Orexin合成/释放增加，Orexin受体表达增加[20-21]。Orexin对学习记忆的影响研究观点不完全一致。Aou等[16]的研究表明，Orexin-A通过影响海马CA1突触的长时程增强抑制损害空间记忆能力。Akbari等[22]的研究则发现，海马CA1注射Orexin-1受体拮抗剂损害Morris水迷宫任务中的记忆的存储、巩固和提取，似乎提示内源性Orexin-A促进大鼠的空间学习和记忆。Akbari等[23]的另一项试验发现CA1区或DG区注射Orexin-1受体拮抗剂后记忆受损，进一步证实内源性Orexin-A在学习中发挥重要作用，也提示Orexin-1受体在大鼠空间学习和记忆中发挥重要作用。另外某些病理情况下注射Orexin-A可改善记忆，如海马内注射Orexin-A可减轻辣椒素治疗引起的学习记忆障碍[24]。临床上Orexin受体拮抗剂Belsomra (suvorexant)已被FDA批准用于治疗失眠[25]，研究表明治疗范围内的Orexin受体拮抗剂DORAs促进睡眠且不影响认知功能[26]。我们推测体内Orexin A维持动态平衡，Orexin A不足或过度增多都可能导致空间学习记忆障碍。

综上，睡眠剥夺损害大鼠空间学习记忆能力的机制可能与下丘脑Orexin A的过度表达有一定关系。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突