来那度胺通过抑制VEGF蛋白表达抑制人肝癌细胞LM3的迁移和侵袭

来佳程，郑亦胡，唐银河

（1.温州医科大学，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第一医院 肝胆外科，浙江 温州 325000）

肝癌是常见的消化道肿瘤，GLOBOCAN数据库的最新统计结果显示，2018 年全球诊断出约84.1万肝癌新病例，并有78.1 万人死于肝癌。肝癌在全球肿瘤中排名第5[1]，在中国恶性肿瘤发病率中排名第4，是中国癌症死亡的第二大原因[2]。虽然肝癌的治疗方式在进步，但由于早期诊断的缺乏及其高转移率和复发率，肝癌的长期预后仍然较差，在中国5年生存率仅14.1%[3]。因此需要进一步研究肝癌转移和侵袭的分子机制，找到新的药物和靶点进行干预。以往的研究发现，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor/vascular endothelial growth factor receptor，VEGF/VEGFR）在肿瘤中往往呈现高表达，VEGF刺激血管内皮细胞生长，形成微血管，对肿瘤进行营养物质供给[4]。在胰腺癌中，VEGF与VEGFR结合后可以激活上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进肿瘤细胞的侵袭[5]。在肠癌细胞发生EMT时，VEGF和VEGFR-1的表达均增加，并通过自分泌途径促进细胞生长，以避免细胞因缺少黏附而凋亡[6]。来那度胺是一种免疫调节药物，并具有良好的抑制血管生成作用，广泛用于各种血液系统疾病。来那度胺具有抑制VEGF表达的效果，被发现可以抑制小鼠肠癌细胞迁移和侵袭[7]并能促进结直肠癌血管正常化，增强化疗效果[8]。本实验旨在研究来那度胺对肝癌细胞LM3迁移和侵袭的影响并探究其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

人肝癌细胞LM3 细胞系（中科院上海细胞库），胎牛血清（美国，Sigma Chemical），E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白抗体（美国，Cell Signaling Technology），VEGF蛋白抗体（美国，Affinity Biosciences），GAPDH抗体（美国，Affinity Biosciences），DMEM细胞培养液和胰蛋白酶（美国，Gibco），蛋白酶抑制剂、RIPA缓冲液（中国北京，Solarbio），羊抗兔二抗（美国，Cell Signaling Technology），Transwell小室（美国，Costar），基质胶（美国，Corning）。

1.2 细胞培养

将人肝癌细胞LM3 培养于含10%胎牛血清，l00 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基。培养环境为37 ℃、5% CO2饱和湿度的恒温培养箱。根据细胞生长情况决定传代时间，用0.25%EDTA胰酶进行消化传代，选择对数生长期的细胞作为实验对象。

1.3 细胞活性测定

细胞增殖实验：将对数期生长的LM3细胞按照8×103个/孔的密度接种到96孔板中，24 h后待肿瘤细胞贴壁，弃去孔内培养液，加入分别含有5、10、20、40、80 µmol/L来那度胺培养基100 µL，以不含来那度胺的培养基100 µL作为对照，每组设置6 个复孔。继续培养24 h、48 h后，分别每孔加入10 µL的CCK-8 试剂，在培养箱内孵育2 h，检测450 nm波长处的吸光度（记为A值），则细胞存活率=[（实验组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）]×100%。

1.4 细胞迁移和侵袭测定

NC组（对照组），Lena组（40 µmol/L来那度胺处理48 h），VEGF组（人重组VEGF 10 ng/mL处理48 h）和VEGF+Lena组（人重组VEGF 10 ng/mL预处理48 h后再用40 µmol/L来那度胺处理48 h）。

划痕实验：分别取普通LM3 细胞及VEGF预处理的细胞5×105个植入6 孔板中，确保贴壁后融合率达到90%～100%。贴壁后用200 μL枪头进行划痕之后，分别加入3 mL普通培养基，40 µmol/L来那度胺，10 ng/mL VEGF。VEGF预处理细胞中加入40 µmol/L来那度胺。拍照记录并重新放回37 ℃恒温培养箱进行培养。48 h后再次拍照，并进行对比。迁移率=[（0 h划痕间面积-48 h划痕间面积）/0 h划痕间面积]×100%。

侵袭实验：取普通细胞以及VEGF预处理的细胞，用无FBS的DMEM培养基重悬细胞，调节细胞浓度1×106个/mL。24孔板中放置好8 μm孔径的铺有matrigel胶的Transwell小室，取200 μL细胞悬液加入上室，下室分别加入800 μL均含15%血清的普通培养基，40 µmol/L来那度胺，10 ng/mL VEGF。VEGF预处理组加入40 µmol/L来那度胺。培养48 h后取出Transwell小室，PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min，轻轻擦去上室没有穿过的细胞。显微镜下记录穿入下室的细胞数量。

1.5 蛋白表达测定

Western blotting实验：提取NC组、Lena组、VEGF组、VEGF+Lena组细胞总蛋白。BCA法进行蛋白定量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）电泳、转膜、封闭，蛋白抗体杂交、显影步骤进行处理。以GADPH为标准，检测E-cadherin、Vimentin、Snail、VEGF的蛋白相对表达值。

1.6 统计学分析

所有分析均在SPSS 19.0软件中进行。取至少3次独立实验，获得的数据用（）表示，多组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验，P＜0.05认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度来那度胺对肝癌细胞 LM3的毒性作用及对VEGF蛋白表达的影响

不同浓度来那度胺（0、5、10、20、40、80 µmol/L）处理LM3细胞24 h和48 h后，各组细胞在450 nm处吸光度值和细胞活力与对照组比较没有统计学差异，各实验组之间比较也无统计学差异（P＞0.05，见图1），这说明5～80 µmol/L浓度的来那度胺对LM3细胞活性没有影响。

图1 不同浓度来纳度胺处理肝癌细胞LM3 24 h和48 h后细胞活性的变化

不同浓度来那度胺（0、5、1 0、2 0、4 0、80 µmol/L）处理LM3细胞48 h后五组VEGF表达量分别为（0.815±0.048），（0.798±0.035），（0.671±0.058），（0.472±0.041），（0.231±0.040），（0.183±0.027），表达量降低呈剂量依赖性，5 µmol/L和10 µmol/L组与对照组比较无统计学差异，20、40、80 µmol/L组与对照组比较均有统计学差异。由于80 µmol/L组与40 µmol/L组无统计学差异（见图2），所以本研究采用40 µmol/L浓度来那度胺进行进一步的实验。

图2 不同浓度来那度胺对肝癌细胞LM3 VEGF蛋白表达的影响

2.2 来那度胺对LM3细胞迁移和侵袭的影响

观察40 µmol/L来那度胺作用下LM3 细胞迁移和侵袭的变化。如图3 所示，来那度胺能有效抑制LM3细胞的迁移和侵袭。具体数据见表1。

表1 不同实验条件处理LM3细胞48 h后细胞的迁移率和侵袭数

图3 来那度胺对LM3细胞迁移和侵袭的影响

2.3 来那度胺对EMT相关蛋白表达的影响

本研究通过蛋白印迹实验证明，在40 µmol/L来那度胺作用下，EMT相关蛋白标志物Snail、Vimentin和VEGF蛋白表达水平下调；Snail作为E-Cadherin的转录抑制因子，其表达量减少使得E-cadherin表达量升高，促进细胞间黏附，从而减少细胞的侵袭性（见图4 和表2）。而在VEGF的作用下，LM3 细胞发生EMT，引起Snail表达升高，进而抑制E-cadherin表达；且VEGF和间质标志物Vimentin表达量也明显升高，导致细胞迁移和侵袭能力明显增强。经VEGF预处理的细胞在来那度胺的作用下，因VEGF表达受到抑制，阻断EMT的持续发生，因此迁移和侵袭程度较VEGF组减弱（见表2）。在此我们得出结论，来那度胺通过抑制LM3 细胞表达VEGF，从而减弱了细胞的侵袭性。

表2 不同实验条件处理LM3细胞48 h后EMT相关蛋白的相对表达值

图4 来那度胺对LM3细胞EMT相关蛋白表达的影响

3 讨论

尽管索拉菲尼作为抗血管治疗的一线药物提高了晚期肝癌患者的总体生存率，却常因耐药性导致治疗失败[9]；但另一方面，抗血管治疗的部分成功提示抗血管治疗仍有巨大的探索空间。已有的研究证明，肠癌、鼻咽癌中肿瘤细胞通过自分泌和旁分泌的形式产生VEGF，与肿瘤细胞膜表面受体结合后激活通路，促使肿瘤发生EMT[10-11]。上皮间质转化是指细胞失去极性并表达间充质细胞特性从而引起细胞黏附能力降低的机制[12]。

在多数肿瘤中VEGF呈现高表达，不仅诱导血管生成，使建立起血液供应系统，从而加速生长和侵袭性[12]。肝癌是一种典型的高度血管增生肿瘤，而肝癌组织中出现VEGF高表达以及术前血浆高VEGF值的患者，总生存率（OS）和无病生存率（DFS）较短[13]，因此有学者提出将VEGF指标作为诊断肝癌预后的重要指标[14]。来那度胺是一款具有抗血管生成作用的药物，已有研究证明来那度胺通过抑制缺氧诱导因子-1（HIF-1）来抑制VEGF的表达，并且通过阻断PI3K-AKT通路来减弱VEGF诱导的内皮细胞的成管作用[15]。在动物实验中使用来那度胺后宫颈癌瘤块边缘及中心血管数量均明显低于对照组[16]。本次实验发现来那度胺具有抑制肝癌细胞LM3 表达VEGF的作用，且随着药物浓度的增加，抑制效果逐渐加强。同时来那度胺处理后增加了E-黏附蛋白的表达，减少了间充质标志物波形蛋白、Snail的表达，从而抑制了肝癌细胞LM3的迁移和侵袭。相反，VEGF与细胞表面受体结合促进LM3 细胞的EMT，增加了LM3细胞的侵袭性，并且在该过程中细胞VEGF表达升高。而来那度胺作用于VEGF预处理的细胞后，抑制了VEGF的表达，减少了其与VEGFR-1结合，因此减少了迁移和侵袭的能力。

本研究我们选用具有高度侵袭性的肝癌LM3细胞进行实验，研究发现来那度胺对肝癌细胞的活性具有抑制作用，但是它能抑制肿瘤细胞表达VEGF，从而抑制细胞迁移和侵袭，因此具有一定的肝癌治疗潜力。