洛铂对结肠癌细胞的抗肿瘤活性及机制研究

刘友强,王贵英,2*,胡冀陶,韩佳旭,席金川,李保坤

(1.河北医科大学第四医院外二科,石家庄 050011; 2.河北医科大学第三医院,石家庄 050000)

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,在世界范围内,结直肠癌的发病率居恶性肿瘤第三位,死亡率居第四位[1]。 在我国,结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年升高趋势,最新数据显示,2015 年中国CRC发病人数为37.63 万例,死亡人数为19.1 万例。 在我国男性第五位、女性第四位高发性恶性肿瘤,位居我国恶性肿瘤死因的第五位[2]。 结直肠癌治疗方式为以手术为主,放化疗为辅的综合治疗。 虽然近年来针对结直肠癌的预防及临床治疗手段均有明显改善,但其发病率和死亡率仍没有显著降低趋势,尤其是Ⅳ期结直肠癌患者的生存率并未见明显的提升,治疗效果仍然不能令人满意。 晚期结直肠癌严重影响患者的生活质量及生存期。

此外,结直肠癌是一种慢性、多基因和非可控性炎症驱使的恶性肿瘤[3],发生和发展机制非常复杂。 因结直肠癌恶性程度较高,肿瘤异质性明显,对放化疗缺乏特异性等特点,导致CRC 对放化疗易产生耐受[4]。 因此,寻找新的有效治疗靶点,探索新的治疗模式,是结肠癌亟待解决的问题。

洛铂(化学式:C9H18N2O3Pt)是第三代抗肿瘤铂类制剂,其抗肿瘤活性与DNA 烷基化和干扰cmyc基因相关[5],具有更强的抗肿瘤作用,且副作用更少。 临床前研究表明,洛铂可打破某些肿瘤细胞对顺铂或卡铂的耐药性[6-7]。 大量临床试验已证明洛铂在多种癌症中具有抗肿瘤作用,洛铂能显著抑制乳腺癌、胃癌、黑色素瘤等癌症[7-10]的侵袭转移,抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,杀伤对肿瘤细胞。

但洛铂在结肠癌中的作用和分子机制很少被研究,其作用及机制尚不明确。 在本研究中,初步探讨洛铂对结肠癌细胞的抑制作用,分析洛铂诱导结肠癌SW480 细胞死亡的类型,并对其作用机制-凋亡相关基因BAD 和BCL-2 表达-进行了探索,为洛铂在结肠癌患者中的应用提供理论依据。 因此,本研究的目的是探索洛铂在结肠癌SW480 细胞中的抗肿瘤活性,阐明潜在分子机制,为临床应用提供理论证据。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人结肠癌SW480 细胞由河北医科大学第四医院科研中心所提供。

1.2 主要试剂与仪器

10%新生胎牛血清(杭州四季清公司);RPM-1640 干粉培养基(美国GIBCO 公司)。 胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙锭均为山东茂军化工科技有限公司;GAPDH、BAD、BCL-2、p-BAD、p-AKT、CASPASE-3 抗体及荧光二抗均购自美国Abcam 公司; MK - 206 和 SC79 购 买自美 国Selleckchem 公司;洛铂购自益佰制药有限公司。MTT 检测试剂盒购买自Abcam 中国;流式细胞仪(美国 Attune NxT 公司);检测细胞凋亡所需的Annexin-V 和 7 -AAD(PI) 购买自百奥莱博;Transwell 小室及克隆形成实验耗材购自美国Corning 科技。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

人结肠癌SW480 细胞用含10%标准胎牛血清的RPM1640,100 μg/mL 链霉素和每毫升100 单位青霉素培养基中培养,细胞培养箱设定为37℃、5%CO2,当细胞密度达到80%～90%时,传代培养,每3 d 传代 1 次。

1.3.2 MTT(四唑盐)比色法

采用MTT 实检测洛铂对结肠癌细胞的抗肿瘤活性。 将SW480 细胞接种在96 孔培养皿中培养过夜,然后用不同浓度梯度的洛铂(0,8,16 和24 μg/mL)与结肠癌 SW480 细胞共培养24 h、48 h 和72 h,采用OD490nm测量各孔的吸光值。 生成细胞活力曲线。

1.3.3 细胞克隆形成实验

采用克隆形成实验检测洛铂对结肠癌细胞的抑制作用。 将SW480 细胞在6 孔培养皿中培养孵化一夜。 将结肠癌细胞与不同浓度梯度的洛铂(0,8,16 和 24 μg/mL)共培养 48 h,然后用新鲜的RPMI 1640 培养基替代含有洛铂的培养基,细胞培养2 周之后,通过固定和染色后,采用光学显微镜对细胞克隆数(超过50 个细胞)进行分析。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

采用细胞取对数期结肠癌SW480 细胞,加入浓度梯度为 0、8、16、24 μg/mL 的洛铂,培养 48 h 后,用不含EDTA 的胰酶消化后,收集细胞。 用预冷1×PBS(4℃)洗涤细胞,加入 100 Ml 1×BindingBuffer重悬细胞。 AnnexinV-FITC 标记细胞后,避光,室温孵育15 min,上机前5 min 再加入5 μL 的PI 染色进行PI 标记,检测细胞凋亡率。

1.3.5 Western blot 检测凋亡相关蛋白

将结肠癌细胞与不同浓度梯度的洛铂(0、8、16、24 μg/mL)共培养 48 h,收集细胞,用 PBS 洗涤,裂解提取蛋白,将50 μg 蛋白加入SDS 凝胶中,电泳将蛋白转运至PVDF 膜上用含有5%脱脂牛奶的TBST 封闭。 一抗 CASPASE-3,BAD,BCL-2,GAPDH(1 ∶1000 稀释)4℃ 过夜,二抗(1 ∶10000)在 37℃ 下孵育2 h,成像显影。

1.3.6 探索洛铂诱导结直肠癌细胞凋亡的机制

MK-206 是一种AKT 抑制剂,SC79 一种新型的AKT 小分子激动剂。 将结肠癌细胞分为4 组,洛铂0 μg/mL 组,洛铂 24 μg/mL 组,洛铂 0 μg/mL+ MK-206 组,洛铂 24 μg/mL+ SC79 组,共培养 48 h,收集细胞,用PBS 洗涤,裂解提取蛋白,将50 μg 蛋白加入SDS 凝胶中,电泳将蛋白转运至PVDF 膜上,用含有5%脱脂牛奶的 TBST 封闭。 一抗 pAKT、AKT、p-BAD、BAD、BCL-2、CASPASE-3、GAPDH(1 ∶1000 稀释)4℃ 过夜,二抗(1 ∶10000)在 37℃下孵育2 h,成像并分析各组蛋白的表达情况,探索洛铂促凋亡机制。

1.4 统计学方法

实验结果数据采用SPSS 21.0 统计软件处理,计量资料以平均数±标准差()表示,组间比较采用t检验,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 洛铂抑制结肠癌SW480 细胞增殖

采用MTT 实验及克隆形成实验检测洛铂对结肠癌SW480 细胞的抑制作用。 为探索洛铂对细胞增殖活性的抑制作用。 本研究采用不同梯度(0,8,16 和 24 μg/mL)的洛铂作用 SW480 细胞 24 h、48 h和72 h,之后进行 MTT 分析。 结果表明洛铂对SW480 细胞增殖活性具有明显抑制作用,且表现出事件和剂量依赖型。 随药物浓度的增加,洛铂的抑制作用逐渐增强,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。 随着作用时间的增加,洛铂的抑制作用也逐渐增强,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。 其抑制率呈时间-剂量依赖关系。 见表1。

细胞克隆形成结果显示,洛铂能抑制结肠癌细胞的克隆形成,抑制细胞增殖,且呈现为剂量依赖型,随着洛铂浓度的增加,抑制作用越明显,结果具有统计学意义。 当洛铂的药物浓度为 24 μg/mL时,显著抑制细胞克隆形成。 见图1。

2.2 洛铂诱导SW480 细胞凋亡

本实验采用流式细胞仪检测洛铂对结肠癌SW480 细胞凋亡的影响。 洛铂作用人结肠癌SW480 细胞48 h 后,研究发现洛铂可诱导SW480细胞凋亡,且随洛铂浓度的增加,细胞凋亡率明显增加。 组间比较结果具有统计学意义(P＜0.05)。结果见图2。

2.3 洛铂调节关键凋亡相关蛋白的表达

本研究采用Western blot 法检测了凋亡相关蛋白CASPASE-3、BAD 与BCL-2 在结肠癌细胞SW480中的表达情况。 结果显示,洛铂作用于结肠癌SW480 细胞24 h 后,与对照组相比,随洛铂的浓度增加,CASPASE-3 的表达量逐渐上升。 随洛铂的浓度增加,BAD 蛋白表达增加,BCL-2 蛋白表达下降,各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),结果见图3A。 BAD 与BCL-2 的比率显著提高,结果具有统计学意义。 见图 3B、3C。

表1 洛铂对SW480 细胞株的增殖抑制作用( )Table 1 The inhibitory effect of lobaplatin on the proliferation of SW480 cell line

表1 洛铂对SW480 细胞株的增殖抑制作用( )Table 1 The inhibitory effect of lobaplatin on the proliferation of SW480 cell line

注:相同洛铂浓度在不同作用时间及在相同作用时间不同洛铂浓度对细胞增殖的对比。 与24 h 组和48 h 组相比,*P＜0.05。 下同。Note. Compared among different time at same lobaplatin concentration and different lobaplatin concentration at the same time on cell proliferation.Compared with 24 h and 48 h group,*P＜0.05. The same as below.

浓度(μg/mL)Concentration 24 h 48 h 72 h OD570 nm OD570 nm OD570 nm Control 0.857±0.034 1.310±0.045 1.454±0.051 0.611±0.054* 0.561±0.044* 0.612±0.008*16 0.520±0.34* 0.524±0.022* 0.559±0.031*24 0.464±0.009* 0.479±0.052* 0.504±0.053*8

2.4 洛铂调节结肠癌细胞凋亡的信号通路

本研究采用AKT 的抑制剂MK-2206 及激动剂SC97 探讨洛铂调节结肠癌细胞凋亡的信号通路。研究发现未采用洛铂处理的结肠癌细胞pAKT 高表达, 抑 凋 亡 基 因p-BAD、 BCL-2 蛋 白 高 表 达,CASPASE3 蛋白未明显表达,当加入AKT 的抑制剂MK-2206 后,pAKT、p-BAD 和 BCL-2 蛋白表达下调,CASPASE3 蛋白表达升高,促进了细胞凋亡。

图1 洛铂抑制结肠癌细胞克隆形成Figure 1 lobaplatin inhibits colon cancer cell clone formation

图2 不同浓度洛铂对SW480 细胞凋亡影响Figure 2 Effect of lobaplatin on apoptosis of SW480 cells

采用 24 μg/mL 洛铂处理结肠癌细胞后,p-BAD、BCL-2 低表达,CASPASE3 蛋白高表达,当联合 AKT 激动剂 SC97 处理后,pAKT、p-BAD 和 BCL-2 蛋白表达上调,CASPASE3 蛋白表达下调,抑制了细胞凋亡(见图4)。

3 讨论

铂类药物被广泛用于多种恶性肿瘤的治疗中,然而,其严重毒副作用限制了其临床应用[11]。 顺铂是第一代铂类药物,对多种实体肿瘤均能产生抗肿瘤疗效。 然而,顺铂药物常伴有剂量限制性肾毒性,胃肠毒性、耳毒性和神经毒性,阻碍了顺铂在临床应用。 卡铂是第二代铂化合物由于其严重的神经毒性和耳毒性,骨髓抑制,特别是血小板减少,同样影响了卡铂的应用。 洛铂(lobaplatin)是第三代铂类衍生物,该复合物中1,2-二氨甲基-环丁烷为稳定配基,乳酸为离去基团。 与前两代铂类药物相比具有明显优势,稳定性好,抗肿瘤活性强,肾毒性轻,胃肠道反应轻,未表现出顺铂的交叉耐药性[12]。

图3 洛铂调节关键凋亡相关蛋白的表达Figure 3 Lobaplatin regulates the expression of key apoptosis related proteins

图4 洛铂调节结肠癌细胞凋亡Figure 4 Lobaplatin regulating apoptosis of colon cancer cells

BAD 蛋白是BCL-2 基因家族的促凋亡成员,其参与启动细胞凋亡。 其不包含外部线粒体膜和核膜靶向的结构域。 当BAD 被AKT 磷酸化时,它形成 BAD-14-3 蛋白异二聚体,抑制细胞凋亡。BAD 蛋白可通过在线粒体外膜上打孔,允许细胞色素c 逃逸到细胞质中并激活促凋亡的CASPASE 级联,来启动细胞凋亡[13]。 抗凋亡BCL-2 蛋白可抑制细胞色素c 通过线粒体孔释放,并且抑制细胞质CASPASE 级联的活化。 既往研究表明活化的AKT可以使BAD 磷酸化,促进细胞存活,否则促进细胞凋亡[14]。

近期临床前发现了洛铂在大多数恶性肿瘤的潜在抗肿瘤机制。 洛铂可阻止细胞周期进程,诱导肿瘤细胞凋亡,改变蛋白质组,抑制肿瘤的迁移和侵袭,下调细胞周期蛋白D1,CDK4, CDK6,MMP-2,MMP-9 和 BCL-2 的表达,上调p53,BAX,PARP,CASPASE-3,-8,-9 等基因的表达[15-17]。 但在结肠癌中的作用尚不明确,本研究以人结肠癌SW480 细胞为模型,探讨其对结肠癌细胞作用。

本实验结果显示洛铂对结肠癌SW480 细胞生长有明显抑制作用,抑制结肠癌细胞的增殖,表现为时间-剂量依赖型。 同时洛铂可诱导结肠癌SW480 细胞凋亡,随着洛铂浓度的提高,洛铂促细胞凋亡的强度表现为增强的趋势,呈现出剂量依赖型。 CASPASE 家族蛋白在细胞凋亡过程中发挥着关键作用[18]。 本研究结果表明,洛铂作用人结肠癌SW480 细胞后,可提高结肠癌细胞中CASPASE-3 的表达量, 促进细胞的凋亡, 表明洛铂可通过CASPASE 信号通路诱导细胞凋亡。 BCL 家族蛋白在调节CASPASE 信号通路诱导细胞凋亡过程中发挥着重要作用。 BAX 和BCL-2 是调控细胞凋亡的主要分子[19-20]。 BAX 可以激活 BCL-xl 和 BAD,促进细胞凋亡的发生,而BCL-2 可以抑制BAX 的表达,抑制细胞凋亡。 BAD/BCL-2 比值在细胞凋亡中一个重要的决定因素[21-22]。 本研究结果显示,不同浓度梯度的洛铂作用人结肠癌SW480 细胞后BCL-2 蛋白表达下调,而 BAD 蛋白表达上升,BCL-2/BAD 比值下降,表明BCL 家族蛋白在洛铂诱导结肠癌细胞凋亡中起着重要的调控作用。

AKT 信号传导途径涉及广泛的细胞功能,包括细胞存活、增殖、血管生成、细胞代谢和细胞迁移。AKT 的激活导致BCL 家族BCL-2 的抗凋亡蛋白的增加。 BCL-2 是一种抗凋亡蛋白,为位于线粒体外膜,通过阻止线粒体释放细胞色素c,抑制细胞凋亡。 细胞色素 c 从线粒体向细胞质的转移是CASPASE-3 活化和细胞凋亡诱导的关键步骤[23]。本研究中发现,AKT 抑制剂能显著抑制BCL-2 蛋白表达,促进BAD 和CASPASE-3 蛋白表达,促进细胞凋亡。 AKT 激动剂能显著抑制BAD 和CASPASE-3蛋白表达,促进BCL-2 蛋白表达,抑制细胞凋亡。本文研究显示,洛铂可能通过AKT/BCL-2/BAD 信号通路发挥促细胞凋亡作用。 洛铂可显著抑制结肠癌的SW480 细胞的增殖,具有剂量和时间依赖性。 洛铂可能通过AKT/BCL-2/BAD 信号通路发挥促细胞凋亡作用。 因此,洛铂可能是一种有效的抗结肠癌药物,但尚需要进一步的研究和临床评价。