基于SDF-1/CXCR4 信号通路探讨新安鼻渊方流浸膏对急性鼻窦炎大鼠嗅上皮神经元细胞凋亡的影响

张 田,喻国冻,顾 平,叶惠平,金 莹

(贵州医科大学附属医院 耳鼻咽喉科,贵阳 550004)

急性鼻窦炎是一种鼻窦黏膜的炎症性疾病[1],作为耳鼻喉科最常见的疾病之一,在全球范围内具有较高的发病率。 在我国,急性鼻窦炎的发病率逐年增加,主要临床症状包括头痛,鼻塞、记忆力下降等[2],其病情反复,难以治愈,严重影响患者的身心健康,是临床上亟需解决的健康问题。 目前,关于鼻窦炎的治疗手段主要是采用鼻内镜外科手术及抗炎药物[3-4],对于患者创伤性大,而且预后效果不佳,存在复发率高、耐药性以及其他不良反应等一系列问题。 新安鼻渊方流浸膏由中草药败酱草、黄芪等药物组成,主要用于治疗急、慢性鼻窦炎,起效迅速,且经过长期临床使用证实其疗效确切[5]。 但是对于新安鼻渊方流浸膏改善急性鼻窦炎的机制研究还未见报道,因此本研究通过建立大鼠急性鼻窦炎模型来探讨新安鼻渊方流浸膏对大鼠急性鼻窦炎嗅上皮神经元细胞凋亡影响的相关机制,为进一步研究以及临床用药提供客观的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

8～10 周龄 SPF 级 SD 雄性大鼠,体重(200±20) g 40 只购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0011],依照我院最新的动物实验管理办法,实验动物均在本实验室SPF 级动物房饲养[SYXK(黔)2018-0001],每笼 3 ～4 只动物,自由饮水、摄食,12 h 光照/ 12 h 黑暗,温度 20℃ ～25℃,相对湿度 40%～70%。,适应性喂养一周后入组,进行相应的操作。 整个动物实验期间严格按实验动物3R 原则给予实验动物人道主义关怀,本实验获本院伦理委员会批准(IACUC2018-027)。

1.2 主要试剂与仪器

新安鼻渊方流浸膏由我院中药制剂实验室制备;金黄色葡萄球菌由我院微生物室从患者标本中分离获得;AMD3100 购买于美国Sigma 公司;TNF-α、IL-1β 酶联免疫试剂盒以及 AEC 显色试剂盒、PBS 购买于北京索莱宝科技有限公司;嗅标记蛋白(olfactorymarkerprotein,OMP)、TUNEL、SDF-1 以及CXCR4 免疫组化试剂以及 cleaved caspase 3、Bax 以及Bcl-2 一抗试剂盒购买于英国Abcam 公司;切片机(Leica,德国);倒置显微镜(OLYMPUS,日本);高速离心机(Eppendorf,德国);紫外分光光度计(Thermo,美国);超低温冰箱(Siemens,德国)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及建模

本研究中40 只大鼠分为4 组每组10 只,包括对照组,模型组(急性鼻窦炎),治疗组(急性鼻窦炎+新安鼻渊方流浸膏),抑制剂组(急性鼻窦炎+CXCR4 特异性抑制剂AMD3100)。 除对照组外,其余各组大鼠均构建急性鼻窦炎模型,建模过程如下:麻醉大鼠,剃除鼻背部毛、沿鼻中线部位皮下注射利多卡因麻醉大鼠,切开皮肤,分离粘膜以暴露上颌窦前壁区,可见左侧上颌窦前壁,暴露上颌窦骨壁,采用2 mm 钻头钻开上颌窦前壁,将无菌生物止血棉塞入窦腔,0.2 mL 金黄色葡萄球菌悬液注入窦腔,缝合伤口,对照组注射等量无菌生理盐水代替,其余操作与同上。 造模后第7 天开始采用灌胃方式连续给药1 周,每天1 次。 其中治疗组给药新安鼻渊方流浸膏按照大鼠体重计算(7 g/kg),抑制剂组给予1 mg/kg AMD3100,对照组以及模型组灌胃等量的生理盐水。 模型的建立通过大鼠鼻窦炎症状评分进行检测[5]:于给药前、末次给药后1 h 分别观察30 min 内大鼠鼻窦炎症状,评分规则如表1,鼻窦炎症状评分总计大于7 分认为模型建立成功。

1.3.2 鼻粘膜组织炎性细胞因子检测

将各组大鼠处死后,分离鼻粘膜并用生理盐水洗涤,收集鼻腔流出液体,离心取上清,采用酶联免疫吸附试剂盒对各组大鼠鼻腔灌洗液中炎性因子TNF-α 以及 IL-1β 的浓度进行测定。 使用多功能酶标仪检测450 nm 处吸光度,用标准细胞因子以及对应浓度作标准曲线,根据标准曲线计算各组样本中TNF-α 以及 IL-1β 的浓度。

1.3.3 免疫荧光观察OMP 蛋白的表达

处死动物后,用手术刀划取左侧窦口1 mm×1 mm 大小鼻顶部黏膜,4%甲醛溶液固定,常规石蜡切片。 切片经PBS 漂洗后加入蛋白酶K-盐酸缓冲液恒温孵育20 min,再经PBS 漂洗后加入山羊血清封闭30 min;滴加稀释好的(1 ∶500)山羊抗鼠OMP,4℃过夜;再加稀释好的(1 ∶500)兔抗山羊荧光二抗,PBS 漂洗后甘油封片,置于荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.3.4 HE 以及免疫组化检测

将上述制备好的各组大鼠的石蜡切片采用二甲苯脱蜡,乙醇脱水,过氧化物酶灭活,血清封闭后分别加入SDF-1 以及CXCR4 的一抗,4℃ 条件下过夜孵育;加入二抗,孵育30 min 后加入链霉素卵白素工作液并在37℃条件下孵育30 min;使用DAB显色,显微镜下观察染色情况。 阳性细胞表示为细胞质呈棕黄色或棕褐色,并采用Image J 软件对于对各组光密度值进行统计。

1.3.5 TUNEL 染色检测各组大鼠嗅上皮神经元细胞的凋亡

取各组大鼠嗅上皮组织,常规方法固定,石蜡包埋切片,二甲苯浸洗两次,梯度乙醇浸洗5 min,风干后3%双氧水-甲醇浸泡10 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,然后4℃预冷乙醇上进行如下操作:0.1%TRItonX-100、0.1%缓冲液处理2 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,加入TUNEL 反应混合液,封口膜密封,暗湿盒反应1 h,温度37℃,PBS 漂洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜进行观察,采用Image J 软件对各组光密度值进行分析。

表1 急性鼻窦炎症状评分标准Table 1 Score criteria for acute sinusitis symptoms

1.3.6 Western blot 检测

将各组大鼠嗅上皮组织样本加入300 μL RIPA裂解液,裂解10 min 后离心5 min(15000 r/min),收集上清。 每组上样20 μg 蛋白样本。 将蛋白样品和上样缓冲液混合均匀,100℃水浴变性3 min,采用10% SDS-PAGE 分离胶电泳,转膜,室温封闭2 h,加入稀释后的 cleaved caspase 3 一抗(1 ∶1000)、Bax 一抗(1 ∶500)、Bcl-2 一抗(1 ∶500)、β-actin 一抗(1 ∶2500),摇床 4℃孵育过夜。 复温后用 PBST 洗涤PVDF 膜三次后加入 HRP 标记的山羊抗鼠 IgG,37℃孵育2 h 之后ECL 显影拍照,保存图像, Image J 软件分析条带的灰度值,以β-actin 作为内参计算各蛋白的相对表达。

1.4 统计学方法

采用软件 SPSS 21.0、GraphPad Prism 5 对实验数据进行统计学分析,数据表示为平均数±标准差(¯x±s),两组数据间比较采用独立t检验,P＜0.05 表示具有统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠鼻窦炎症状评分

给药前模型组与各给药组评分相比,评分无统计学差异(P＞0.05),模型组和各治疗组评分结果显著高于对照组(P＜0.05)。 给药后模型组评分显著高于对照组,各治疗组评分显著低于模型组(P＜0.05),治疗组与抑制剂组组在评分上相比无统计学差异(P＞0.05)见表2。

2.2 OMP 荧光标记结果

成熟的嗅上皮神经细胞OMP 荧光染色后红色荧光表示阳性,本实验中标本切片为OMP 阳性细胞,说明实验取材位置为嗅觉黏膜,可用于后续的实验研究,见图1。

2.3 大鼠嗅上皮组织HE 染色以及炎性因子检测

与对照组比较,模型组大鼠嗅上皮组织损伤严重,且 TNF-α 以及 IL-1β 显著增加(P＜0.05);治疗组与模型组相比嗅上皮组织损伤减轻,TNF-α 以及IL-1β 表达明显降低(P＜0.05);治疗组组与抑制剂组相比,炎性因子 TNF-α 以及 IL-1β 表达无显著差异(P＞0.05),见图 2。

2.4 大鼠嗅上皮神经元细胞凋亡

与对照组比较,模型组大鼠嗅上皮神经元细胞凋亡显著增多(P＜0.05);与模型组相比,治疗组组与抑制剂组大鼠嗅上皮神经元细胞凋亡减少(P＜0.05),治疗组与抑制剂组相比无明显差异(P＞0.05)见图 3。

2.5 大鼠嗅上皮组织SDF-1、CXCR4 的蛋白表达

相比于对照组,模型组大鼠嗅上皮组织SDF-1、CXCR4 的蛋白表达显著升高(P＜0.05);治疗组与抑制剂组大鼠与模型组相比嗅上皮组织SDF-1、CXCR4 的蛋白表达明显降低(P＜0.05);治疗组与抑制剂组相比无明显差异(P＞0.05),见图4。

2.6 大鼠嗅上皮组织caspase-3、Bax 以及Bcl-2 的表达

相比于对照组,模型组大鼠嗅上皮组织重促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表达显著升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平明显降低(P＜0.05);治疗组与抑制剂组大鼠与模型组相比嗅上皮组织促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表达明显降低(P＜0.05)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达显著增加(P＜0.05);治疗组与抑制剂组相比无明显差异(P＞0.05),见图 5。

3 讨论

急性鼻窦炎是发生于鼻窦粘膜的一种炎症性疾病,主要病理特征为各种窦口狭窄或阻塞,以及黏膜纤毛功能发生障碍。 作为耳鼻咽喉科的常见病和多发病,其主要的临床表现为嗅觉功能障碍,同时会伴有鼻塞、鼻痒、流涕、打喷嚏、头痛、头昏等症状[6]。 其病因复杂,发病机制尚不明确,牵涉因素众多,可能与细菌感染、过敏反应、环境因素等多种因素有关[7-9]。 在急性期若没有得到及时治疗则会转变为慢性鼻窦炎,严重影响患者正常生活。

近年来,中药应用于鼻炎的研究受到众多研究者的重视[10-11]。 新安鼻渊方流浸膏主要包含中药败酱草、黄芪、鱼腥草、辛夷等[12-13]。 该方具有清热解毒、祛瘀排脓、止痛通窍的功效。 败酱草具清热解毒、排脓消痈、止痛之功,被广泛用于治疗肺经蕴热、胆经(腑)郁热所导致的鼻渊症状[14]。 黄芪能排脓通窍,补益正气,敛疮生肌,现代药理学证实其可增强机体免疫[15]。 相关研究[5]表明新安鼻渊方流浸膏对于急性鼻窦炎有很好的治疗效果。 常见的急性鼻窦炎致病菌有金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌等[16],因此本研究中,采用金黄色葡萄球菌构建急性鼻窦炎大鼠模型。 结果表明模型组大鼠鼻窦炎症状评分以及嗅上皮神经元细胞凋亡比例显著多于对照组,证明模型建立成功。 新安鼻渊方流浸膏组大鼠的嗅上皮神经细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的表达明显低于模型组,表明新安鼻渊方流浸膏对于大鼠急性鼻窦炎具有明显的改善作用。 但是,对于新安鼻渊方流浸膏治疗急性鼻窦炎的相关机制目前仍不清楚。 因此,本研究构建大鼠急性鼻窦炎模型来探究新安鼻渊方流浸膏对于鼻窦炎的调节作用以及其相关机制。

图1 OMP 免疫荧光结果Figure 1 Results of OMP immunofluorescence

图2 HE 染色观察各组大鼠鼻黏膜病理变化Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P ＜0.05. The same as below.Arrow indicates eosinophilic infiltration.Figure 2 Pathological changes of nasal mucosa of rats in each group were observed by HE staining

图3 各组大鼠嗅上神经元细胞凋亡Figure 3 Apoptosis of upper olfactory neurons in each group

图4 免疫组化检测各组大鼠SDF-1、CXCR4 的表达Figure 4 Expression of SDF-1 and CXCR4 in each group was detected by immunohistochemistry

图 5 caspase-3、Bax 以及 Bcl-2 蛋白表达水平Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with control group,*P＜0.05.Compared with the model group,#P＜0.01.Figure 5 Expression levels of cleaved caspase 3, Bax and Bcl-2

表2 给药前后大鼠鼻窦炎评分表(n=10)Table 2 Scores of sinusitis of rats before and after administration

近年来,趋化因子受体 CXCR4 以及 SDF-1/CXCR4 相互作用形成的信号通路由于参与多种疾病的发生以及发展而备受关注[17]。 其中SDF-1 作为一种趋化因子,由炎性反应因子如TNF-α、IL-1β所诱导,由于其对炎性反应细胞具有强大的趋化能力,因此常被作为炎性反应的特异性指标。 此外,CXCR4 是一个G 蛋白偶联受体,作为SDF-1 唯一的受体,CXCR4 多表达于免疫细胞之中,对细胞生长发育至关重要。 目前,研究证明SDF-1/CXCR4 信号通路对细胞凋亡具有明显的调节作用[18-19]。 此外,相关研究[20-21]表明SDF-1/CXCR4 在鼻炎鼻粘膜中呈现高表达现象,提示该通路参与鼻炎鼻粘膜病变的发生和发展。 B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)是一种抗凋亡蛋白,以线粒体为单位参与细胞凋亡的调控,其同源二聚体X 蛋白(Bax)是一种促凋亡蛋白,Bcl-2 和Bax 是在凋亡调控过程中功能对立的一对重要的调控基因,cleaved caspase 3 作为凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白酶诱发细胞凋亡[22-23]。 众多研究[24-25]证实:SDF-1/CXCR4 通路的激活导致 Bax、cleaved caspase 3 等促凋亡蛋白表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 表达降低最终诱发细胞凋亡。 本研究中,相比于模型组,治疗组大鼠SDF-1 以及CXCR4 的表达显著降低,同时促凋亡蛋白表达明显降低,抗凋亡相关蛋白的表达显著增高,而给予CXCR4 特异性抑制剂AMD3100 处理后,大鼠病理变化与治疗组相似。 以上结果提示,新安鼻渊方流浸膏对于急性鼻窦炎大鼠嗅上神经元细胞凋亡的改善作用可能是通过抑制SDF-1/CXCR4 信号通路实现的。

综上所述,本研究通过建立大鼠急性鼻窦炎模型验证了新安鼻渊方流浸膏可能通过抑制SDF-1/CXCR4 的表达,从而抑制嗅上皮神经元细胞的凋亡,最终改善急性鼻窦炎症状。 然而急性鼻窦炎的发生发展涉及因素众多,机制复杂,因此新安鼻渊方流浸膏改善变急性鼻窦炎嗅上皮神经元细胞凋亡的具体机制有待深入研究。