“鼠衣秋千式”大鼠温针灸固定方法的研究与探索

涂仕娟,陈 鹏,杨红亚*

(1.成都中医药大学基础医学院,成都 611137; 2.成都中医药大学医学与生命科学学院,成都 611137)

针灸作为中医学体系里的独特分支,除秉承中医整体调节和辨证论治的优势外,更具备操作简便、起效迅速、物理刺激不良反应小等特点[1],随之而来的针灸疗效机制研究是目前中医学研究的热点之一。 动物模型为针灸疗效机制研究提供了良好的载体,大鼠是针灸机制研究中最常用的动物之一。 但是目前对大鼠针灸实验固定方法的研究较少,常用的固定方法有束缚法[2]、束袋法[3]、鼠筒法[2,4]、输液瓶固定法[5]、置高台法[6]等。 课题组在进行膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)模型大鼠温针灸治疗时曾尝试这些固定方法,结果发现此类方法存在大鼠应激反应强烈、取穴部位受限、掉针、仅适合特定部位单纯针刺,不适用于针灸治疗、固定器型号只适用于限定体重动物等局限性。 因此,选择一种操作简便,又能减少针灸治疗中动物应激反应的固定方法,是针灸机制研究中面临的一个关键问题。

如何减少大鼠固定和治疗过程的应激反应呢?笔者联想到荡秋千时双腿悬空、足部无着力点、下肢无法发力的体验,受此启发,反复实践后设计了一种大鼠温针灸的“鼠衣秋千式”固定方法,以KOA模型大鼠为实验对象,观察固定及治疗过程动物的应激反应,并评估该方法的适用范围,同时与温针灸治疗中常用的束缚法进行对比。 结果显示,“鼠衣秋千式”固定法中的大鼠在固定及温针灸治疗过程中应激反应较小,四肢部位穴位充分暴露,1 名实验人员即可独立完成对大鼠的固定和治疗,操作简便。 现将“鼠衣秋千式”固定装置的制作及使用方法介绍如下,供各位同仁参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性 SD 大鼠 60 只,体重(250±20) g,7周龄,来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],饲养于成都中医药大学科研创新中心屏障环境动物房[SYXK(川)2020-124]。 本实验通过成都中医药大学实验动物福利伦理审查(2019-14),并严格按照动物使用的减少、优化、替代“3R”原则进行设计。

1.2 主要试剂与仪器

废弃的白大褂(或旧衣料),剪刀,缝衣针,缝衣线,3 mm×400 mm 的自锁式塑料尼龙扎带,长3 m、宽15 cm 布带条1 根,S 形小号挂钩若干,50 mm 规格的长尾夹,小号镊子,帆布手套,乳胶手套(海门市扬子医疗器械有限公司);1 mL 一次性无菌注射器(成都市新津事丰医疗器械有限公司);0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司);碘乙酸钠(MIA)(美国 Sigma-Aldrich 公司);宠物电推剪(型号:RFCZ-572,九江亨利电器有限公司);0.25 mm×25 mm 华佗牌一次性无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司);1.2 cm×1.5 cm 的小艾炷(湖南省高圣生物有限公司);碘酒(四川金山制药有限公司);75%乙醇(山东安捷高科消毒科技有限公司),硬纸板,打火机,艾灰盒。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

大鼠适应性喂养2 周后,选取体重(400±20) g的大鼠采用碘乙酸钠(MIA)膝关节腔注射的方法复制KOA 模型[7-9],关节腔注射同等体积无菌生理盐水的大鼠设置为空白组。 饲养环境日光灯12 h 明暗更替照明,安静且通风,温度(23±2)℃,相对湿度50%～70%,大鼠自由摄食饮水。

1.3.2 固定装置制作及使用方法

(1)制作方法

将清洁后的旧白大褂衣料缝制成摊开尺寸为50 cm×13 cm 的筒状鼠衣,用剪刀在上面分别开2个φ2.5 cm 和φ3.5 cm 的孔,用以掏出大鼠的前后肢,大小两孔之间距离为17 cm,见图1。

(2)使用方法

造模2 周后,筛选复制成功的KOA 大鼠模型进行温针灸治疗[10-12],其中20 只大鼠采用常规的束缚法固定,20 只大鼠采用“鼠衣秋千式”固定。 每只大鼠温针灸治疗每日1 次,5 次为1 个疗程,共2 个疗程,疗程间间隔2 d。

①鼠衣固定

操作者戴好手套,将大鼠置于粗糙的台面上,左手抓住鼠尾向后轻拉,右手将鼠衣的一端口打开,利用大鼠喜暗喜钻洞的习性,将其置于鼠衣口处,大鼠会自行钻入其中,见图2。 当大鼠钻到鼠衣中间时,头部则完全被鼠衣覆盖。 左手隔着鼠衣迅速握住大鼠躯干,找到上肢与躯干连接处,拇食中三指从腹部方向夹持住大鼠两侧的肩胛骨,右手掏出大鼠的两前肢。 在左手掌心与大鼠的躯干间留出缝隙,将尼龙扎带从缝隙中穿过,围绕鼠衣一周将大鼠前端固定,见图3。 最后采用相似的方法固定大鼠身体后端,使其双侧后肢位于鼠衣外面。 完成上述操作后,观察大鼠是否出现张口呼吸、反应剧烈等情况,根据动物反应调整尼龙扎带束缚的松紧。 针灸组大鼠体型体重相似,测量束缚大鼠所用尼龙扎带围绕身体前端及后端一周所需的长度,并用记号笔对新扎带做标记,有助于快速有效地固定下一只大鼠。 操作熟练之后1 人完成此固定过程约需要1 min。

②秋千式悬挂

图1 鼠衣成品图Figure 1 Finished design of rat’s coat

图2 大鼠钻进鼠衣Figure 2 Rat getting into coat

取一段3 m 长的布带条,每隔8 cm 左右剪1 个小孔,用来放置S 型挂钩以悬挂大鼠。 将布带条两端固定于实验室墙角两侧的墙壁,布带条距离地面高度约为70 cm,以实验人员坐在凳子上操作舒适省力为宜。 在大鼠前肢和后肢对应部位的鼠衣上分别开孔,用S 型挂钩悬挂于布带条上对应的孔内,使大鼠悬挂于布带条上,处于“荡秋千”微微摆动的状态。 借助S 形挂钩调节大鼠身体前后端与布带条之间距离,使大鼠头部在上,身体与地面呈45 度倾斜,见图4。 最后用长尾夹收紧大鼠后肢根部的鼠衣,以充分暴露取穴部位。 操作熟练后1 人完成悬挂过程约需要30 S。

③温针灸治疗

大鼠针灸侧腿部皮肤剃毛后,穴区用碘酒消毒后再以75%的乙醇脱碘,定位,毫针针刺腧穴,进针深度为5～7 mm。 将艾炷置于针柄,点燃艾炷下端,每次30 min,进针前在毫针上穿上隔热纸板以防止温针灸过程烫伤大鼠,见图5。 治疗过程多数大鼠处于闭目休息状态,针灸治疗过程较为顺利,见图6。 治疗结束后,取针和隔热纸板,出血部位按压止血、消毒。 剪开尼龙扎带,解开大鼠的束缚,将其放回鼠笼。

图3 固定大鼠Figure 3 Rat being fixed

图4 秋千式悬挂Figure 4 Swinging rats

1.3.3 “鼠衣秋千式”固定法与束缚法的比较

从完成操作所需实验人员数量、单只大鼠固定所需时间、大鼠在固定及温针灸治疗时的反应等方面比较“鼠衣秋千式”固定法与束缚固定法。

图5 温针灸治疗Figure 5 Needle warming moxibustion treatment

图6 温针灸治疗中的大鼠Figure 6 Rat in needle warming moxibustion treatment

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析,实验数据以平均数±标准差()表示,以P＜0.05 时表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同固定方法固定单只大鼠所需实验人员数量及时间的对比

完成大鼠固定和治疗所需实验人员数量以及固定单只大鼠所需时间如表1 所示。 可见,与束缚组相比,采用“鼠衣秋千式”法1 人即可完成固定和温针灸治疗;固定单只大鼠所需时间显著减少(P＜0.01)。

2.2 温针灸治疗中不同固定方法组大鼠的反应对比

温针灸治疗过程,不同固定方法组大鼠的反应见表2。 “鼠衣秋千式”固定组有2 只大鼠在首次绑缚时候出现了较激烈的反应,占实验组大鼠总数的比例为10.00%,在随后的9 次固定操作中,其应激反应逐渐减弱。 束缚组有7 只大鼠在操作中出现了反应激烈、呼吸急促、烫伤等情况,所占比例为35.00%。 “鼠衣秋千式”固定组大鼠未出现攻击咬伤操作人员情况,而束缚组大鼠在操作中有挣脱束缚、攻击操作人员行为;“鼠衣秋千式”固定组大鼠在整个温针灸2 个疗程治疗中,未见烫伤和死亡,有2 只大鼠出现掉针情况,而束缚组中则有12 只大鼠出现了挣扎掉针情况,占比高达60.00%,有6 只大鼠在捆绑或治疗过程中死亡,占比达30.00%。

表1 不同方法固定单只大鼠所需人数、时间的对比( ,n=20)Table 1 Comparison of the number of people and time required for fixing a single rat by different methods

表1 不同方法固定单只大鼠所需人数、时间的对比( ,n=20)Table 1 Comparison of the number of people and time required for fixing a single rat by different methods

注:与束缚组(对照组)比较,*P＜0.01。Note. Compared with the bound rats Group (control group),*P＜0.01.

组别Groups完成操作所需人数(人)Number of people required单只大鼠固定时间(s)Time of fixing single rat鼠衣秋千式组Swinging rats bound with coat Group 1 89.20±3.93*束缚组Bound rats Group 2 110.85±15.64

表2 温针灸治疗中不同固定方法中大鼠的反应对比(n=20)Table 2 Comparison of rats’ reactions in different fixation methods in needle warming moxibustion

3 讨论

“鼠衣秋千式”大鼠温针灸固定装置制作简单、操作简便,只需1 个实验人员即可完成全部操作。与束缚固定法相比,该固定方法能减少所需操作人员数量,缩短固定单只大鼠的时间,有效地提高了实验效率;大鼠在固定以及温针灸治疗中的挣扎情况得到显著缓解,掉针大鼠数量减少,未发生烫伤、咬伤操作人员等情况;鼠衣秋千式大鼠在2 个疗程的温针灸治疗中未出现死亡情况。 “鼠衣秋千式”大鼠温针灸固定法,能使大鼠治疗部位穴位暴露充分,操作安全简便,且能提升工作效率,是一种较为适用于大鼠四肢部位温针灸的固定方法。

理想的大鼠针灸固定方法应具有取穴方便、无应激刺激、操作安全简便等特点,但就目前而言基本上难以完全做到。 为了尽可能降低固定对大鼠造成的应激反应对实验结果的影响,课题组通过研究文献、观察大鼠习性,结合荡秋千体验,反复实践改良后设计了“鼠衣秋千式”固定法。

与其他大鼠针灸固定方法相比,该法具有以下优点:第一、充分利用了大鼠喜欢黑暗环境和喜欢钻洞的生活习性,在其头部被鼠衣覆盖的情况下进行固定,有效地降低了大鼠被固定时的应激反应,且鼠衣能缓冲和分散固定时产生的束缚力,防止了大鼠的窒息死亡;第二、被“秋千式”悬挂于布带条上的大鼠由于四肢和趾部无着力点无法发力,在整个30 min 的温针灸治疗过程中比较安静,多数大鼠处于闭目睡觉状态,配合度较高,切实避免了剧烈挣扎导致的烫伤、攻击操作人员等情况发生,保证了针灸时效的稳定性;第三、大鼠四肢部位穴位暴露充分,便于治疗。 此方法既适合于单纯针刺治疗,也适用于温针灸治疗;第四、鼠衣尺寸可调整,固定装置适用范围较广,不仅适用于各种体型的大鼠,还可用于小鼠、豚鼠等动物;第五、实验人员熟练操作后固定和悬挂一只大鼠约需要1.5 min,且不需助手即可单独完成,提升了工作效率。 另外,该固定方法还具有取材方便、制作简单、操作灵活等特点。

“鼠衣秋千式”大鼠温针灸固定方法也存在一定的局限性,该法主要适用于动物四肢部位取穴治疗,而对于头部、背部以及腹部的针灸治疗,则需要对鼠衣进行改良。 课题组将继续改良和优化该固定方法,以期操作更简便,适用治疗的部位更广,并进一步降低固定时实验动物的应激反应对针灸疗效的干扰作用。