Marcksl1 基因敲除小鼠的建立及造血表型初步分析

李 博,高丽娟,于 磊,张 旭,李争光,刘 宁,史旭东,高 凯,李 静,高 珊,齐晓龙,张连峰,马元武*

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心,北京 100021; 2.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

血液是生命的动力源泉,造血伴随整个生命进程,造血系统发育包括原始造血和定向造血两个阶段[1]。 胚胎发育的第7 天(E7 d),小鼠原始造血发生于卵黄囊的血岛,产生原始的有核红细胞及髓系祖细胞。 定向造血最早出现于主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonepluos,AGM)区,在胚胎发育的E11.5 d 造血干细胞在 AGM 区生成[2]。 E12.5 d时,造血干细胞从AGM 区通过血液循环到达小鼠胎肝并迅速增殖。 E15.5 d 时造血干细胞从胎肝向脾中迁移,同时胎肝中的造血干细胞逐渐减少[3]。E17.5 d 时造血干细胞从脾向骨髓中迁移并最终定居于骨髓[4]。 整个胚胎期造血干细胞的发生、迁移和成熟涉及多个组织器官,这些组织器官对造血系统发育至关重要,造血发育调控已成为研究者们的探究重点和热点内容。 造血系统发育是一个精细且复杂的调控过程,涉及一系列的调控因子包括TGF-β、BMP4、Notch1、RUNX1 和 GATA2 等。 研究表明TGF-β 的表达损伤会影响小鼠卵黄囊的血管生成并导致造血功能缺陷[5-6]。 Dzierzak 和 Speck在2009 年证实RUNX1 和GATA2 调控内皮细胞向造血细胞的转化过程,从而影响造血干祖细胞的生成以及存活[7-8]。 另外一项研究则表明WNT 通路对AGM 中内皮细胞向造血干细胞的转化以及造血干细胞的生成至关重要[9]。 尽管目前对小鼠造血过程已有较深入的了解,但是由于造血过程的复杂性,真正了解完整的造血过程仍有很长的路要走。寻找新的造血干细胞发育的关键调控因子,对于进一步了解造血发育过程和治疗血液系统疾病具有重要意义。

豆蔻酰化的富含丙氨酸 C 激酶底物蛋白1(Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate like 1,MARCKSL1),属于 MARCKS 家族成员,又称为MARCKS 相关蛋白(MRP),MARCKS 样蛋白(MLP)和脑蛋白 F52[10]。 MARCKS 家族蛋白包括MARCKS 和MARCKSL1 两个家族成员,其包含三个保守的功能域: (1) MARCKS 同源结构域 2(MARCKS Homology 2, MH2)域;(2)N 末端结构域,该结构域可以进行可逆的豆蔻酰化;(3)效应结构域(effector domain, ED),富含带正电荷的氨基酸残基,易于被蛋白激酶C(PKC)或其他蛋白激酶磷酸化[11]。 MARCKSL1 在被蛋白激酶磷酸化后,从细胞质侧膜转移到细胞质中,参与调控细胞侵袭和迁移,血管运输以及各种信号转导等多种生理活动[12-13]。 已有研究表明,MARCKSL1 在整合素激活、大脑发育、细胞粘附调控、细胞吞噬、粘蛋白分泌、有丝分裂以及血管生成等活动中发挥作用[14-16]。 并且,MARCKSL1 缺失会造成小鼠神经管闭合缺陷[17]。 目前,尚未发现Marcksl1 在造血系统发育中的功能和作用。

在前期工作中,我们发现Marcksl1 基因在造血干细胞中高表达,并且在老年小鼠的造血干细胞中表达显著升高,提示其可能在造血干细胞发育过程发挥重要作用。 为研究该基因在造血干细胞中的功能,我们利用CRISPR/Cas9 系统建立了Marcksl1基因敲除小鼠,并通过对其进行初步分析,发现该基因缺失造成的小鼠胚胎致死发生在胚胎发育后期。 随后通过对小鼠胚胎期造血干细胞进行流式分析,发现Marcksl1 缺失影响造血干细胞的占比。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验中使用SPF 级,C57BL/6 品系小鼠,均为 2 ～3 月龄,体重为 20 ～30 g,雌雄各 10 只。C57BL/6 小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司[SCXK(京)2020-0004],饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所SPF 级动物房[SYXK(京)2019-0011],同时动物饲养间采用12 h 交替明暗照明,动物自由饮水进食。 实验过程中严格遵循了3R 原则,且涉及的动物相关实验均得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用及管理委员会(IACUC)的批准(ILAS-MYW20005)。

1.2 主要试剂与仪器

单链DNA 片段(北京天一辉远生物科技有限公司);DNA 提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司); 琼脂糖粉( Biowest Agarose 公司);MEGAshortscript T7 转录试剂盒(AM1354,Ambion,美国);Lin 流式抗体(BD,美国);Sca1(BD,美国);c-kit(BD,美国);流式细胞仪(BD,美国);高速离心机(Eppendrof,德国);PCR 扩增仪(Bio-Rad,美国);PCR 仪 (伯 乐, 美 国); Micro-PET/CT 扫 描 仪(Inveon,Siemens,Berlin,德国);数码凝胶成像处理系统(天能,中国);全血分析仪(Siemens,德国)。

1.3 实验方法

1.3.1 制备Marcksl1 基因敲除小鼠

利用本实验室建立的CRISPR/Cas9 基因编辑平台,建立Marcksl1 基因敲除小鼠。 针对Marcksl1基因我们设计了两个 sgRNA 靶点(靶点 1:GGTGATGTTGGATGGGAGTGAGG: 靶 点 2: GGG AAGAACTTAAACCAACCAGG)。 通过将寡核苷酸片段 M- Marcksl1-E2A-gRNAup: TAGGTGATGTT GGATGGGAGTG 和 M- Marcksl1-E2A-gRNAdown:AAACCACTCCCATCCAACATCA; M-Marcksl1-E2B-gRNAup: TAGGGAAGAACTTAAACCAACC 和 MMarcksl1-E2B-gRNA down: AAACGGTTGGTTTAAGT TCTTC 分别退火后连接到PUC57-gRNA 载体中,构建sgRNA 表达载体,利用试剂盒MEGAshortscript T7进行体外转录获得sgRNA。 利用PMSG 和HCG 超排3～4 周龄的C57BL/6 小鼠后,与成年的雄性小鼠交配,次日从输卵管中获得受精卵。 利用显微注射仪通过将 sgRNA (10 ng/μL),Cas9 蛋白(30 ng/μL)共同注射到小鼠受精卵内,随后将受精卵移植到假孕母鼠中,等待小鼠出生后进行基因型鉴定,确定靶基因是否实现敲除。

1.3.2 胚胎组织的取材

将Marcksl1 敲除杂合子2 月龄雌鼠与2 月龄雄鼠于前一天进行合笼,并于次日早晨进行阴道栓检查,如能够检测到阴道栓当天标记胚胎为E0.5 d。怀孕母鼠于E15.5 d 或者E17.5 d 时处死,解剖获得E15.5 d 及E17.5 d 的胚胎。 分离小鼠胚胎进行称重并记录,剪取少量胚胎组织用于基因型鉴定,随后将胎肝从胚胎中小心剥离,并去除多余组织称重记录,用于后续实验。

1.3.3 小鼠基因组DNA 提取

将E15.5 d 小鼠或E17.5 d 小鼠胚胎组织置于1.5 mL EP 管中并加入120 μL 鼠尾裂解液,经过55- 60℃ 孵育过夜,裂解过后按照基因组提取试剂盒说明提取基因组DNA,提取的基因组DNA 溶于0.1× TE 中,用于后期基因型鉴定。

1.3.4 小鼠的基因型鉴定

对获得的胎鼠进行基因型鉴定,用M-Marcksl1-WT-F/M-Marcksl1-WT-R 引物鉴定野生型条带,片段大小 1923 bp。 用 M-Marcksl1-KO-F/M-Marcksl1-KO-R 引物鉴定敲除条带,片段大小为316 bp。 PCR反应条件: 95℃ 预变性5 min;95℃变性 30 s,62℃退火 30 s,72℃ 延伸 30 s,29 个循环。 PCR 反应结束后,用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳并成像。 引物序列见表1。 将得到的电泳结果进行分析,只有野生型条带的为野生型小鼠,只有敲除条带的为敲除纯合子小鼠,两者都有的为杂合子小鼠,统计分析小鼠基因型。

1.3.4 血常规

将E15.5 d 胚胎经断头取外周血收集于冷PBS中,采用全自动血液分析仪对胚胎外周血进行血液组分分析。

1.3.5 胎肝细胞流式分析

将分离获得的小鼠胎肝置于1 mL PBS 溶液中,用1 mL 注射器反复轻轻的抽吸吹打3～4 次进行单细胞化,随后按照表2 中的流式组合进行染色,流式上机进行分析。

1.3.6 小鼠胚胎CT 扫描

将查栓获得的小鼠胚胎整体固定于4%多聚甲醛中,固定完成后使用 Micro-CT 扫描仪(Inveon,Siemens,Berlin,德国)对小鼠全身进行扫描分析。CT 扫描参数设定为:电压:60 kV,电流:400 μA,分辨率为20 μm。 扫描结束后使用Inveon 分析工作站进行CT 图像重建及数据分析,计算股骨长度进行统计。

表1 Marcksl1 基因敲除小鼠基因型鉴定引物Table 1 Primers used in this study for Marcksl1 gene knockout mice genotype

1.4 统计学方法

本文中基因型占比采用卡方检验分析,其余所涉及数据均采用平均数±标准差()表示,使用Graphpad prism7 软件进行统计学分析,并且两组间比较采用 Student’st-tests。 当P＜0.05 时,则表示差异具有显著的统计学意义。

表2 流式流式组合Table 2 The antibody combination used for flow cytometry

2 结果

2.1 建立Marcksl1 基因敲除小鼠

为研究Marcksl1 在造血系统中的作用,我们利用CRISPR/Cas9 系统建立Marcksl1 基因敲除小鼠,构建策略如图1A 所示。 对获得的F0 代小鼠进行基因型分析,其中2 只(2/5)为基因敲除小鼠,敲除效率为40%。 随后我们对#2 小鼠进行传代基因型和测序分析,结果显示敲除片段能够有效的传递给子代小鼠(图1B),并对传代小鼠基因敲除片段测序分析,敲除测序图谱如图1C 所示,通过与参考序列比对分析,结果显示敲除片段大小为1500 bp 图1D 所示。 综上,我们成功在小鼠基因组中敲除了Marcksl1 基因的第二外显子,并能稳定传代。

2.2 Marcksl1 基因缺失导致小鼠胚胎致死

图1 建立Marcksl1 基因敲除小鼠Note. A, Schematic overview of CRISPR/Cas9 system mediated Marcksl1 gene knockout in mice, targeting site1 and site2 are the sgRNA target sites. B, Germline transmission of Marcksl1 gene knockout mice (#2). (All the F1 mice produced from founder #2 were heterozygous.M, Marker, DL2000. 1-6, Founder #2, and F1 generation number #1-#5. Wild type brand was 1923 bp and the knockout brand was 316 bp); C. The chromatographs from sequences of truncated PCR products; D, The sequences results of truncated PCR products. The deleted DNA fragments of Marcksl1 were shown.Figure 1 Establishment of Marcksl1 knockout mice

在Marcksl1 基因敲除小鼠繁殖过程中,未获得纯合敲除小鼠,通过对胚胎期小鼠基因型检测,发现该基因缺失会造成小鼠颅骨发育缺陷,导致小鼠胚胎致死(图2A),这与之前的报道一致[18]。 随后我们分析了E15.5 d 和E17.5 d 的小鼠胚胎,统计Marcksl1 基因敲除小鼠的占比。 对59 只胎鼠的基因型分析,发现E17.5 d 纯合子小鼠的占比显著低于E15.5 d 纯合子的比例,敲除小鼠在E15.5 d 时占比40%,而在 E17.5 d 时比例不足10%(表3)。对E15.5 d 和E17.5 基因型占比进行卡方检验分析(χ2 值为 28.225,P 值为 7.432×10-7),发现存在统计学差异,表明Marcksl1 基因缺失造成的死亡发生在胚胎发育后期。 随后对胚胎E17.5 d 小鼠进行CT 扫描分析,发现Marcksl1 基因敲除会导致小鼠骨骼发育异常(图2B)。 通过对小鼠的股骨长度进行统计分析,结果显示敲除小鼠的股骨长度与野生型相比较短(图2C)。

2.3 Marcksl1 基因缺失不影响胚胎血细胞数量和比例

前期工作中,通过RNA-seq 数据分析,发现该基因在小鼠的造血干细胞中高表达,并在老年小鼠中表达显著升高,为研究该基因在造血干细胞中的作用,我们分析了基因敲除后胎肝的发育情况。 通过对E15.5 d 小鼠胎肝称重,发现Marcksl1 敲除小鼠胎肝重(图3A)以及肝重体重比(图3B)与野生组相比无明显差异。 同时我们对E15.5 d 小鼠的外周血进行血常规分析(图3C),结果显示敲除小鼠组的红细胞,白细胞与血小板的占比与野生组相比无明显差异。

2.4 Marcksl1 敲除促进胎肝中造血干细胞增殖

为了研究Marcksl1 的缺失对造血干细胞的影响。 我们通过流式细胞术对E15.5d 的小鼠进行胎肝KSL 细胞(Lin-/Sac1+/c-Kit+cell)占比分析,结果显示Marcksl1 基因敲除小鼠胎肝中的造血干细胞显著高于对照组中(图4A,4B),进一步对造血干细胞进行分类发现与野生组相比敲除小鼠的长期造血干细胞(Long-term hematopoietic stem cell, LT)占比较高(图4C, 4D)。 这些结果表明Marcksl1 缺失能够导致造血干细胞数量增加。

3 讨论

MARCKSL1 在多种组织中表达[11],参与整联蛋白活化,细胞粘附,细胞迁移,吞噬作用,血管生成和脑发育的调控[12,19-21]。 MARCKSL1 最初被发现在巨噬细胞中高表达,且调节巨噬细胞的功能。MARCKSL1 能够被PKC 磷酸化,结合肌动蛋白影响胞质移位, 进而调节巨噬细胞的吞噬[22]。MARCKSL1 还在免疫系统中发挥重要的调节作用,包括促进炎症细胞的迁移以及细胞因子的分泌。前期工作中,我们发现Marcksl1 基因在造血干细胞中高表达,并且在老年小鼠的造血干细胞表达显著升高,提示MARCKSL1 可能在造血干细胞衰老中发挥重要作用,但是关于MARCKSL1 在造血系统中的功能仍不清楚。 本研究中,通过CRISPR/Cas9 系统建立了该基因的敲除小鼠,发现敲除Marcksl1 基因导致的死亡发生于胚胎发育后期。 随后,取胚胎小鼠的外周血进行血常规检测,结果显示与对照组相比,Marcksl1 基因敲除小鼠的白细胞,红细胞以及血小板的数量没有明显的变化。 并且通过流式细胞术对E15.5 d 胚胎小鼠的胎肝细胞进行染色分析,表明MARCKSL1 缺失导致胎肝中造血干细胞数量增多。

表3 E15.5 d 以及E17.5 d 中不同基因型胚胎的数量以及占总胚胎数的比例Table 3 The number and percentage of different genotypes in total E15.5 and E17.5 embryo

图2 Marcksl1 基因缺失对小鼠发育的影响(n≥5)Note. A, The picture of E15.5 WT and Marcksl1-knockout mouse. B, The skull images of WT and Marcksl1 gene knockout mice scanned by CT. C, The femur length of WT and Marcksl1 gene knockout mice scanned by CT. Compared with wild type, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 2 The function of Marcksl1 gene deletion on mouse development

图3 Marcksl1 基因敲除小鼠肝发育和血细胞占比分析(n≥5)Note. A, The weight of E15.5 fetal liver. B, Quantitative analysis of the radio of liver weight to body weight. C, The results of E15.5 Peripheral blood routine (WBC, White blood cells, RBC, Red blood cells, PLT, Platelets). ns, Not significant.Figure 3 Analysis the liver development and blood cell ratio in Marcksl1 gene knockout mice

MARCKSL1 主要定位于细胞质侧膜上,通过与PIP2 作用,可以控制 PIP2 的水解,PIP2 被 PLC(phospholipase C)选择性水解,产生三磷酸肌醇(IP3) 和 DAG (diacylglycerol), 也可以被 PI3K(phosphoinositide 3-kinase) 磷 酸 化, 生 成 PIP3(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate)。 因此,MARCKSL1 的磷酸化状态影响了细胞信号通路效应因子,包括磷脂酶D (PLD)和磷酸肌醇激酶3(PI3K),后者通过 PIP2 磷酸化到 PIP3 激活 AKT信号从而调控下游信号分子[23]。 Liang 等[24]发现MARCKSL1 通过调节AKT / SNAI2 通路促进肺腺癌细胞的细胞增殖, 迁移和侵袭。 此外,MARCKSL1 在PI3K/AKT 等信号通路的调节中发挥了重要作用,并在肝癌、乳腺癌,肺癌中高表达,调节肿瘤细胞的增殖、凋亡以及迁移。 免疫系统调控与造血系统密不可分,造血干细胞功能的变化直接影响免疫应答过程。 本研究通过建立Marcksl1 基因敲除小鼠,初步证明了该基因缺失会影响造血干细胞数量,但是Marcksl1 如何调节造血干细胞发育和造血稳态平衡仍需进一步研究。 通过本研究,我们成功建立了Marcksl1 基因敲除小鼠,为研究MARCKSL1 在造血干细胞和胚胎发育的功能提供了动物模型支持。

图4 Marcksl1 基因敲除对胎肝中造血干细胞的影响(n≥5)Note. A, Analysis of the E15.5 fetal liver KSL cell by flow cytometry analysis. B, The proportion of KSL cell in E15.5 fetal liver. C, The flow cytometry result of LT(long-term hematopoietic stem cells), ST(short-term hematopoietic stem cells), and MPP(multipotent progenitor cells) from E15.5 fetal live. D, The proportion of LT, ST, and MPP in E15.5 fetal liver. Compared with wild type,*P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Effect of Marcksl1 gene knockout on hematopoietic stem cell