漆姑草总黄酮大孔树脂纯化工艺研究

耿 亚 赵喜兰 张 强

1.漯河医学高等专科学校第二附属医院，河南 漯河 462300;2.漯河医学高等专科学校，河南 漯河 462002

漆姑草(SpergulajaponicaSw．)为石竹科植物漆姑草的全草，分布于东北、华北、华东、中南、西南及陕西、广西等地，具有凉血解毒、杀虫止痒之功效[1]。文献显示[2]，漆姑草总黄酮对肿瘤具有一定的抑制作用，其中已分离得到的主要黄酮衍生物有：6，8-二-C-葡萄糖基芹菜素、6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖基芹菜素、8-C-葡萄糖基芹菜菜、x″-O-鼠李糖基-6-C-葡萄糖基芹菜素[3]。目前，漆姑草总黄酮多采用溶剂提取法，但该法溶剂用量比较大，所得黄酮含量不高[4]，还需要进一步纯化。大孔树脂是一种重要的聚合物吸收剂，常用于自然资源中生物活性化合物的制备分离和纯化。由于其高效，低污染和操作简单的特点，大孔树脂已被广泛用于从天然植物中分离和纯化活性成分，包括黄酮、生物碱、类萜和皂甙等[5]。本研究系统分析不同极性的大孔树脂对漆姑草总黄酮的吸附和解吸能力，在最佳条件下，使用选定的树脂纯化漆姑草总黄酮。

1 材料与仪器

1.1 试验药物 漆姑草采集于贵阳花溪，经漯河医学高等专科学校赵喜兰副教授鉴定为石竹科植物漆姑草SpergulajaponicaSw．的全草；芦丁对照品购自南京景竹生物科技有限公司(批号：20180211)。

1.2 主要试剂与仪器 D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、AB-8及ADS-F8大孔树脂均购自天津南开和成科技有限公司；其余试剂均为分析纯。R-220 旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂；双光束紫外可见分光光度计购自上海谱元仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 含量的测定

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取芦丁对照品12.38 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇5 mL，超声辅助溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为0.495 mg/mL的芦丁对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称定漆姑草(粉碎，过40目)1 g，加入75%甲醇50 mL，超声辅助提取30 min，过滤，置于50 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 标准曲线的制备 精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别吸取上述芦丁溶液0.5 mL与2.5 mL蒸馏水混合，然后加入5%(m/v)的NaNO2溶液(150 μL)。 6 min后，加入250 μL10%(m/v)AlCl3·6H2O溶液，静置5 min，加入1.0 mL 1.0 M NaOH。用蒸馏水将混合物调至5.0 mL，并充分混合。使用紫外可见分光光度计于510 nm处测量吸光度，以吸光度(Y)为纵坐标，芦丁质量浓度(X)为为横坐标，建立回归方程，Y=9.847X-0.0059，r=0.9998。线性范围为0.025～0.198 mg/mL。

2.1.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，参照“2.1.3”分别于15、30、60、90、120 min测定吸光度，结果RSD为0.31%，表明样品溶液在0～120 min呈色比较稳定。

2.1.5 重复性试验 取同一批漆姑草6份，每份1g，参照“2.1.2” 项制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液，参照“2.1.3” 测定吸光度，结果漆姑草中总黄酮的平均含量为2.164 mg/g，RSD为0.48%，表明样品溶液重复性较好。

2.1.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，参照“2.3”连续6次测定吸光度值，结果RSD为0.47%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 加样回收试验 称取已知含量的漆姑草(含量2.164 mg/g)粉末9份，每份0.5 g，分别按照已知含量的80%、100%、120%加入芦丁对照品溶液(0.495 mg/mL)，参照“2.1.2”制备供试品溶液，测定吸光度，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验 (n=6)

2.2 上样品溶液的制备 将漆姑草自然风干至恒重，粉碎，过40目，称取500 g，加20倍量的 80%乙醇浸泡1 h，然后加热并在80 ℃回流提取3次，每次2 h。合并滤液，抽滤后用旋转蒸发仪将滤液浓缩到原体积的1/6，超声辅助溶解20 min，过滤，定容到100 mL作为样品溶液，漆姑草总黄酮质量分数为10.82 mg/mL，冰箱保存备用。

2.3 树脂的筛选

2.3.1 静态吸附和解吸实验 将3 g(M)树脂放入250 mL锥形瓶中，加入100 mL(V) 浓度为1.082 mg/mL(C0，样品溶液稀释10倍)样品溶液，25 ℃ 100 rpm振荡吸附24 h，通过UV分析吸附后总黄酮的总浓度(C1)，每种树脂的静态吸附实验重复3次。振荡吸附24 h后，用100 mL蒸馏水洗涤树脂，然后用100 mL 70%乙醇解吸。将装有解吸溶液的锥形瓶在25 ℃ 100 rpm连续振荡24 h，分析解吸溶液中总黄酮的浓度(C2)。每种树脂的静态解吸实验重复3次。其中静态吸附量Q(mg/g)=(C0-C1)×V/M，吸附率(%)=(C0-C1)/C0，静态解析率(%)=(C2×V)×100%/(M×Q)。

表2显示，所选的树脂中，AB-8树脂的吸附量明显高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-F8，吸附率和解吸率明显高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、ADS-F8树脂(P<0.05)，因此，选择AB-8树脂作为漆姑草总黄酮纯化的最佳树脂。

表2 静态吸附和解吸实验结果 (n=3)

2.3.2 吸附动力学实验 将3 g AB-8树脂置入锥形烧瓶中，加入浓度为1.082 mg/mL样品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振荡吸附，分别在30、60、90、120、180、240、300、360 min不同的时间间隔内，监测溶液中总黄酮的浓度，计算吸附率。

图1显示，AB-8树脂在0～90 min内吸附率呈现明显的增加趋势，120 min时吸附率最高。然后，伴随时间的推移，吸附率变化不大，故AB-8树脂吸附时间选择120 min。

2.3.3 解吸动力学实验 将3 g AB-8树脂置入锥形烧瓶中，加入浓度为1.082 mg/mL样品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振荡吸附120 min，100 mL蒸馏水洗涤， 100 mL(V) 70%乙醇解吸，分别在30、60、90、120、180、240、300 min不同的时间间隔内，监测解吸液中总黄酮的浓度，计算解吸率。

图2显示，0～120 min黄酮的解吸率呈现明显的增加趋势，120 min解吸率达到最高。然后伴随时间的推移，解吸率无明显的变化。故黄酮解吸时间选择120 min。

2.4 纯化漆姑草总黄酮工艺

2.4.1 样品溶液浓度对吸附率的影响 AB-8树脂湿法装柱，将浓度分别为8.608、4.304、2.152、1.076、0.586、0.293 mg/mL漆姑草总黄酮样品液70 mL上样至预处理的层析柱(2.6 cm × 40 cm)顶部，室温(25 ℃)下保持40 min，以达到黄酮充分吸附。吸附后，用2 BV蒸馏水以2 BV/h体积流量淋洗AB-8树脂，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算吸附率。

图3显示，总黄酮浓度在0.293～1.076 mg/mL时，吸附率较好，并呈现明显的上升的趋势。而总黄酮浓度在1.076～8.608 mg/mL时，吸附率呈现明显的下降趋势。可能是黄酮浓度较低时，便于树脂吸附，而高浓度的黄酮易堵塞树脂微孔，吸附率下降。故上样液浓度选择1.076 mg/mL。

2.4.2 样品溶液体积对吸附率的影响 AB-8树脂湿法装柱，将浓度为1.076 mg/mL漆姑草总黄酮样品液上样至层析柱(2.6 cm × 40 cm)，上样体积流量为2 BV/h，收集流出液，每管10 mL，检测总黄酮浓度，绘制吸附泄露曲线。

图4显示，上样体积1～6 BV时，泄漏液中总黄酮浓度较低，且变化不大，而7 BV时，AB-8树脂基本达到饱和状态，泄漏明显。故上样液体积选择6 BV。

2.4.3 pH对吸附率的影响 AB-8树脂湿法装柱，将70 mL pH分别为3、4、5.7、6、7、8的样液(总黄酮质量浓度1.076 mg/mL)上样至层析柱(2.6 cm × 40 cm)，上样体积流量为2 BV/h，并在室温(25 ℃)下保持40 min，以达到黄酮充分吸附。用2 BV蒸馏水以2 BV/h体积流量淋洗AB-8树脂，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算吸附率。

图5显示，pH从3～5.7，总黄酮的解吸率呈现明显的上升趋势，然后伴随pH的增加，解吸率呈现明显的下降趋势。其原因可能是酸性过大，容易形成烊盐，而pH过大会破坏黄酮的化学结构。故pH选择5.7，即原液的pH。

2.4.4 乙醇体积分数对解吸率的影响 AB-8树脂湿法装柱，将70 mL的样液(总黄酮质量浓度1.076 mg/mL)上样至预处理的层析柱(2.6 cm × 40 cm)，上样体积流量为2 BV/h，流出液重复上样一次，2 BV蒸馏水冲洗，3 BV不同浓度的乙醇(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)以2 BV/h体积流量进行解吸，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算解吸率。

图6显示，伴随乙醇体积分数的增加，解吸率呈现明显的增加趋势，当体积分数达到70%时，解吸率最佳，故乙醇体积分数选择70%。

2.4.5 洗脱液体积对解吸率的影响 AB-8树脂湿法装柱，将70 mL的样液(总黄酮质量浓度1.076 mg/mL)上样至预处理的层析柱(2.6 cm × 40 cm)，上样体积流量为2 BV/h，流出液重复上样一次，2 BV蒸馏水冲洗，然后采用1、2、3、4、5 BV体积分数70%的乙醇以2 BV/h体积流量进行解吸，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算解吸率。

图7显示，伴随洗脱体积的增加，解吸率呈现明显的增加趋势，当洗脱体积达到3 BV时，解吸率最佳，继续增加洗脱体积，解吸率变化不大。故洗脱体积选择3 BV。

2.4.6 洗脱流速对解吸率的影响 AB-8树脂湿法装柱，将70 mL的样液(总黄酮质量浓度1.076 mg/mL)上样至预处理的层析柱(2.6 cm × 40 cm)，上样体积流量为2 BV/h，流出液重复上样一次，2 BV蒸馏水冲洗，然后采用70%的乙醇分别以1、2、3、4 BV/h体积流量进行解吸，收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的浓度，计算解吸率。

图8显示，流速为1～2 BV/h时，解吸率较高。伴随流速的增加，解吸率呈现明显的下降趋势。但流速过低，洗脱时间将明显延长，故流速选择2 BV/h。

2.5 验证实验 选择三份样品，每份500 g，在最佳纯化工艺条件下，分别进行吸附-解吸实验，计算纯化后漆姑草总黄酮的质量分数，结果平均总黄酮质量分数为75.50%，RSD 为 1.21%，表明本研究所建立的 AB-8 树脂纯化漆姑草总黄酮的方法稳定、可靠。见表2。

表2 中试试验

3 讨论

紫外分光光度法是测定总黄酮含量比较常用的方法，具有操作简便、高效、快速的特点，已被广泛应用于黄酮的定量分析。本研究中，通过方法学考察发现，该法稳定性较好，溶液在0～120 min呈色比较稳定。实验的可重复性和仪器精密度良好，加样回收率达到95.48%～101.25%，可作为测定漆姑草总黄酮的有效方法。

目前，黄酮类化合物的纯化主要应用大孔吸附树脂和聚酰胺树脂。与聚酰胺树脂相比，大孔吸附树脂具有吸附容量大、选择性好、再生简便、价格低廉等优点，在黄酮类化合物的分离纯化中得到广泛应用[6]。本研究选择非极性(D101、ADS-5型)、弱极性(AB-8、ADS-17型)以及极性(NKA-9、ADS-F8型)大孔树脂，系统地研究和比较6种树脂的吸附和解吸能力，初步考察不同类型树脂对草果总黄酮的富集效果。结果显示，AB-8树脂因其出色的吸附和解吸能力而被选择为最佳吸附剂，与漆姑草总黄酮极性特征对应。本研究在预试验基础上，对上样液浓度、上样液体积、上样液pH、洗脱液乙醇体积分数、洗脱液体积、洗脱流速进行了单因素试验，结果漆姑草总黄酮纯化的最佳工艺条件为：进料溶液在pH值为5.7、上样液体积6 BV，在25 ℃原始总黄酮浓度为1.076 mg/mL的条件下进行。静态洗脱和动态洗脱溶液选择为体积分数为70%的乙醇、洗脱液体积3 BV、洗脱流速2 BV/h以提高漆姑草总黄酮的解吸率。通过AB-8树脂进行动态吸附和解吸后，最终产品中总黄酮质量分数为75.50%。

总之，本研究以漆姑草总黄酮含量为指标，以分光光度法作为定量分析手段，利用AB-8树脂开发了一种从漆姑草中分离纯化黄酮类化合物的可行而有效的方法。