HPLC法测定维生素D3软胶囊中抗氧剂二丁基羟基甲苯的含量

周惠惠 胡立学 刘佳佳 梅兴国，3*

1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北真奥医药研究院有限公司，湖北 咸宁 437000；3.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850

二丁基羟基甲苯(Butylated hydroxytoluene,BHT)作为一种脂溶性抗氧剂，稳定性高，抗氧化能力强，是我国生产量最大的抗氧化剂之一，常用于食品、保健品、药品中[1]。2020版中国药典[2]中收录该品种的含量测定采用高效液相色谱法，也有文献[3-4]采用气相色谱法。本文参照2020版中国药典及相关文献[5-7]并在此基础上进行优化，建立了高效液相色谱法测定维生素D3软胶囊中抗氧剂BHT的含量，现报导如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 40D高效液相色谱仪(岛津公司)；XSE105电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)；XW-80A涡旋混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 试药 甲醇为色谱纯(天津赛孚瑞科技有限公司)；乙醇为色谱纯(天津赛孚瑞科技有限公司)；纯化水(杭州娃哈哈集团有限公司)；二丁基羟基甲苯对照品(中国食品药品检定研究院，批号190065-201602)；维生素D3软胶囊(批号200617、200712、200723，自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：DiamonsilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：A相为甲醇-水(9∶1)、B相为甲醇-乙醇(8∶2)，梯度洗脱(0～10 min时为A；10～30 min时为B；30～40 min时为A)；检测波长：278 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 称取BHT对照品约10mg置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为BHT储备液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液的配制 称取维生素D3软胶囊内容物适量(相当于BHT 0.2 mg)置20 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解涡旋5 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，静置分层，取上清液过滤进样。

2.2.3 空白溶液的配制 按处方组成及工艺制备不含BHT的空白辅料，按“2.2.2”供试品溶液的配制方法进行配制空白溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 按照“2.1”色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液进样检测，记录色谱图，观察在主峰出峰位置是否有干扰。结果显示，在278 nm处，供试品溶液中的BHT保留时间约为7 min与对照品溶液保留时间相同，空白溶液在主峰位置无干扰。色谱图如图1所示。

2.3.2 线性考察 精密称量BHT对照品约10.87 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得108.7 μg/mL的对照储备液。用甲醇溶液逐级稀释，制得浓度分别为5.44 μg/mL、8.70 μg/mL、10.87 μg/mL、13.04 μg/mL、16.31 μg/mL的对照品溶液。按照2.3.2项的色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积(y)对浓度(x)进行线性回归，得回归方程：y=10067.15x-1031.8，(R2=0.9999)。结果表明，在5.44～16.31 μg/mL范围内，BHT峰面积与浓度呈良好线性关系。如图2所示。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液(10 μg/mL)重复进样6次，记录峰面积。结果BHT峰面积RSD为0.30%，表明仪器精密度良好，色谱条件稳定。见表1。

2.3.4 重复性试验 取同一批的样品(批号为200617)平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件，记录峰面积，计算含量。结果RSD为1.02%，表明本方法重复性良好。见表2。

2.3.5 回收率试验 称取BHT对照品约10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为BHT储备液溶液。精密吸取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为BHT对照品溶液，平行配置2份。精密称量9份空白辅料(按处方比例不加入BHT)置50 mL量瓶，分3组，每组3份，各组分别精密加入BHT对照储备液4 mL、5 mL、6 mL,(分别相当于BHT处方量的80%、100%和120%)，加入适量甲醇溶解并涡旋5 min，用同样的溶剂稀释并至刻度，静置分层，配制成低、中、高三种浓度的供试品溶液，取上清液过滤，按“2.1”项下色谱条件进样，计算回收率及RSD值。结果表明平均回收率98.2%，RSD为1.52%。见表3。

表1 精密度试验结果

表2 重复性试验结果

表3 回收率试验结果

2.3.6 溶液稳定性 取自制样品(200723批)按“2.2.2”项制备成供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h，按“2.3.2”色谱条件进样检测，记录峰面积，计算RSD值。结果显示：BHT的RSD值为0.66，表明样品溶液在24 h内稳定。见表4。

2.4 样品含量测定 取三批样品(200617、200712、200723批)按照“2.2.2”项配制供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进样，计算含量。结果显示含量符合要求。见表5。

表4 溶液稳定性试验结果

表5 含量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择 用甲醇配制成一定浓度的二丁基羟基甲苯(BHT)对照品溶液，在200～400 nm之间进行紫外波长扫描。扫描结果显示，BHT在278 nm处有最大吸收峰，因此将选择278 nm为BHT含量测定检测波长。

3.2 流动相的选择 2020版中国药典BHT含量测定记录流动相为甲醇-水(9∶1)，但本制剂内容物中含有植物油，在BHT出峰附近有较大的杂质峰，因此，笔者选择流动相甲醇-水(9∶1)及甲醇-乙醇(8∶2)进行梯度洗脱，使植物油洗脱出来同时不干扰BHT的含量测定。

3.3 提取方法的选择 BHT可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，不溶于水，本实验研究的是从植物油中提取BHT,笔者选择极性更大的甲醇作为提取溶剂，在提取次数上考察一次提取与三次提取BHT含量的多少，结果显示两者含量无明显差别，因此选择用甲醇一次提取的作为样品处理方法。