齐墩果酸通过Wnt/β-catenin信号通路诱导骨肉瘤细胞凋亡的研究

王志国，饶艳伟

(1.赤峰市松山医院骨科，内蒙古 赤峰 024005；2.吉林省人民医院重症医学科，吉林 长春 130021)

骨肉瘤是一种常见的骨癌，有很高的侵袭能力和强的转移能力，治疗方法局限。手术治疗是对骨肉瘤治疗的主要方法，但还是很多转移案例。化疗是唯一有效控制骨相关转移的治疗手段。Wnt/β-catenin信号通路在多种癌症的产生、进展和转移中扮演一个重要的角色，包括骨肉瘤。Wnt/β-catenin信号通路的构成蛋白被用来作为骨肉瘤诊断的分子生物学标记。在很多研究中发现了抑制了Wnt/β-catenin信号通路可以抑制骨肉瘤的分化、成瘤和转移能力，同时也发现异常的Wnt/β-catenin信号通路活化也可以导致一些表观遗传学的改变[1]。齐墩果酸是一种天然的五环三萜类化合物，可以从120种药草和蔬菜中提取出来。研究认为齐墩果酸有很多种活性，主要为护肝作用，抗炎作用和抗肿瘤作用。随着现代医学研究的进展，发现齐墩果酸在脑胶质瘤、乳腺癌、骨肉瘤、肝癌和肺癌等肿瘤中有很好的抗癌作用[2-4]，其抗肿瘤活性的主要机制是细胞周期阻滞的诱导。但是齐墩果酸是否通过Wnt/β-catenin信号通路诱导骨肉瘤产生凋亡至今还没有被阐述。

1 材料与方法

1.1药品及主要试剂：齐墩果酸(美国 Sigma)，p-β-catenin蛋白抗体(美国 abcam)，Nuclear β-catenin蛋白抗体(美国 abcam)，3，3'-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒。

1.2方法

1.2.1细胞培养和实验分组：本次研究经过赤峰市松山医院医学伦理委员会同意。人骨肉瘤U2OS和KHOS细胞长春润医生物科技有限公司赠予。U2OS和KHOS细胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，5% CO2的恒温二氧化碳细胞培养箱中培养，并保持一定的湿度。所有细胞均采用0.4%胰酶消化传代培养。当细胞培养24 h后，给予更换含不同浓度的齐墩果酸培养液；实验分组：Con组：10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。OA组：40 μmol/ml的OA处理骨肉瘤细胞作用36 h。

1.2.2MTT检测U2OS和KHOS细胞增殖率：按使用说明书用MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法检测细胞生存能力。全自动酶标仪(波长570 nm)测定各孔OD值，计算细胞生存率。

1.2.3流式细胞术检测Sub-G0/G1值：骨肉瘤细胞在加入不同浓度的OA后，36 h收集细胞，加入70%的乙醇，通过碘化丙啶(PI，200 mg/ml)固定，之后通过Aria Ⅱ sorter流式细胞仪分析(BD Biosciences)，每组计数10 000个细胞，统计出Sub-G0/G1值。

1.2.4Western Blot检测U2OS和KHOS细胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表达：提取细胞总蛋白，Bio-Rad法测定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量试剂盒说明书步骤操作，测定样品的蛋白浓度。用Image J图像处理软件计算各条豆类灰度值，分析p-β-catenin和Nuclear β-catenin蛋白表达情况。目的蛋白与内参照β-肌动蛋白(β-actin)的灰度值的比值进行描述表达情况。

1.2.5TOPFlash Reporter分析：β-catenin入核之后才能触发了经典Wnt信号通路活化，β-catenin与转录因子TCF/LEF结合后，形成复合物之后才能引导调控下游基因的转录。因此，将数个拷贝的TCF/LEF的 DNA结合位点(AGATCAAAGGgggta，大写碱基为DNA结合序列，小写的碱基为间隔序列)克隆至含TA病毒最小启动子(Minimal TA viral promoter)的萤火虫荧光素酶报告系统载体中，构建得到TOP-Flash质粒(Millipore,MA)。本研究将TOP-Flash质粒与脂质体2000(Invitrogen)混合后，TOP-Flash质粒可随着β-catenin的活性的改变，来影响了下游萤火虫荧光素酶(pRL-TK)(40:1)(Promega,WI)的表达量。将上述混合物过夜，48 h候后，通过用细胞裂解液(Promega,WI)收集细胞，之后通过光度仪(Promega)测量荧光强度。取得通常以TOP/FOP的比值，即为Wnt信号通路活化的程度。

2 结果

2.1MTT检测骨肉瘤细胞增殖率：随着OA浓度增加和作用时间延长，骨肉瘤细胞的增殖率呈浓度和时间依赖性。在40 μmol/ml作用36 h U2OS细胞增殖率为(51±3.6)%，KHOS细胞增殖率为(57.66±2.52)%。提示40 μmol/ml作用36 h骨肉瘤细胞有显著毒性作用，见图1。

图1 MTT检测骨肉瘤U2OS和KHOS细胞增殖率

2.2流式细胞术检测骨肉瘤U2OS和KHOS细胞的Sub-G0/G1比值：与对照组相比，骨肉瘤U2OS和KHOSOA组的Sub-G0/G1比值水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)。见图2。

图2 流式细胞术检测骨肉瘤U2OS和KHOS细胞的Sub-G0/G1比值

2.3TOPFlash Reporter Assays检测骨肉瘤细胞TCF/LEF的转运活性：对照组相比，OA组TCF/LEF比值明显降低，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3。

图3 TOPFlash Reporter Assays检测骨肉瘤细胞TCF/LEF的转运活性

2.4Western Blot检测骨肉瘤U2OS和KHOS细胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表达：与对照组相比，OA组p-β-catenin的表达水平增加(P<0.001)，而Nuclear β-catenin的表达水平降低(P<0.001)，见图4。

图4 Western Blot检测骨肉瘤U2OS和KHOS细胞中p-β-catenin和Nuclear β-catenin的表达

3 讨论

Wnt/β-catenin通路主要通过调节细胞质内的β-catenin蛋白进入细胞核内的水平发挥作用，细胞质内的β-catenin通过影响其末端的NH2降解结构域被磷酸化，通过β-TRCP1或者β-TRCP1的复合被多聚泛素化，之后通过泛素蛋白酶体介导的降解系统降解[5-6]。当Wnt受体出现时，与Wnt结合到受体复合物上，引起细胞内蛋白Dvl活化。活化Dvl引起GSK-3β被抑制，导致多蛋白复合物分解，β-catenin不能被泛素化降解，导致其发生堆积，之后被转运入细胞核，与TCF/LEF结合，进而活化其下游的靶基因[7]。

本研究我们发现通过给予不同浓度的OA处理的骨肉瘤U2OS和KHOS细胞后，细胞增殖率随着浓度增加和时间的延长，增殖率逐渐降低，这说明OA可以抑制骨肉瘤细胞的增殖率，随后流式细胞术发现Sub-G0/G1比值水平也明显增加，这说明了OA也能增加了U2OS和KHOS细胞的凋亡的发生。通过查阅文献发现，OA可以抑制膀胱癌、肝癌和乳腺癌等癌症细胞增殖和增加细胞凋亡[3,8-9]。为此研究进一步探讨OA是诱导骨肉瘤细胞发生凋亡的，研究发现随着OA浓度增加TCF/LEF的转运活性水平明显降低，同时p-β-catenin的表达随着OA的浓度增加而增高，Nuclear β-catenin的表达随着OA的浓度增加而降低。这说明了OA影响着骨肉瘤细胞浆中的p-β-catenin水平，进而降低细胞核中的β-catenin表达，引起下游基因TCF/LEF的转运活性降低来影响细胞凋亡的发生。