凝结芽孢杆菌抑菌性能的研究进展

■柳成东 赵 平 王乙茹 王春羲 程志斌*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.达州职业技术学院，四川达州635001；3.昆明三正生物科技（集团）有限公司，云南昆明650217）

2020年7月1日我国饲料与养殖业全面实施饲料“减抗”“禁抗”以来，饲用益生菌等有效“替抗”饲料添加剂的研究越来越受到关注（程志斌等，2017；夏涛等，2018；王乙茹等，2020）。参照饲用抗生素改善畜禽生产性能的主要机理——抑菌作用（柳成东等，2020），当前各类创新研发的替抗饲料添加剂（包括饲用益生菌）均在积极评估其抑菌作用，以验证“替抗”动物试验的应用效果（夏涛等，2018；杨保和等，2018；夏涛等，2019）。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）2013年12月正式列入我国《饲料添加剂品种目录》，近7年的科学研究与生产实践均表明，凝结芽孢杆菌具有抑制畜禽肠道有害菌、调控肠道菌群的作用（Lee等，2018；Zhou等，2020）。然而，本课题组汇总了国内外凝结芽孢杆菌抑菌实验和（或）实验报道发现，凝结芽孢杆菌抑菌性能的研究客观存在“评估方法繁杂、判定标准不统一、系统性研究不足”等诸多问题。文章综述与分析了以上这些问题，提出未来凝结芽孢杆菌抑菌性能研究的方向，以明确凝结芽孢杆菌抑菌作用及效果，为凝结芽孢杆菌在饲料及养殖业的替抗应用奠定科学基础。

1 凝结芽孢杆菌抑菌性能评估的研究方法

凝结芽孢杆菌抑菌性能的评估研究主要包括二类，体外抑菌实验评估（in vitrobacteriostatic evaluation）和体内抑菌实验评估（in vivobacteriostatic evaluation）。凝结芽孢杆菌体外抑菌实验评估已采用的方法包括：牛津杯法（Majeed等，2016；Fu等，2018）、最小抑菌浓度法（郭丰庆等，2020）、杀菌能力法（Pan等，2013）、平板划线法（陈桂芳等，2018）等。体内抑菌实验评估一般通过检测饲喂凝结芽孢杆菌的动物肠道食糜及粪便中标志性特定细菌的数量（肠道有害菌、肠道有益菌），来评估饲用凝结芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控效果，尤其是评估对肠道有害菌的抑制作用。肠道特定细菌数量检测一般采用平板计数法（Lan等，2017；Khajeh等，2020）、实时荧光定量PCR法（赵娜等，2017；Pu等，2018）、宏基因组测序法（Wu等，2018；Li等，2019）等。

牛津杯法是体外抑菌实验评估凝结芽孢杆菌抑菌作用的最常用方法（姚晓红等，2015；张韵等，2017；严涛等，2018；李静舒等，2020）。然而，汇总以往的实验报道（见表1）发现，牛津杯法评估凝结芽孢杆菌抑菌性能的存在的问题是：以抑菌圈直径值（diameter of inhibition zone,DIZ）来判断抑制作用的标准尚未统一（冯媛媛等，2017）。姚晓红等（2015）用牛津杯法评估凝结芽孢杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用，采用的抑菌作用判定标准是：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“中敏感”（10 mm＜DIZ＜20 mm）和“低敏感”（DIZ＜10mm）。Fu等（2018）用牛津杯法同样评估凝结芽孢杆菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用，采用判定标准是：“高敏感”（DIZ＞12 mm）、“低敏感”（6 mm＜DIZ＜12 mm）和“不敏感”（DIZ＜6 mm）。最新的李静舒等（2020）的研究，将牛津杯法评估凝结芽孢杆菌抑制大肠杆菌的判定标准分为4个档次：“高敏感”（DIZ＞20 mm）、“中敏感”（16 mm＜DIZ＜20 mm）、“低敏感”（7.8 mm＜DIZ＜12 mm）和“不敏感”（DIZ＜7.8 mm）。以上抑菌作用判定标准的差异造成凝结芽孢杆菌抑菌效果无法比较。

传统的平板计数法能够直接检测肠道特定菌及属的总数，其优点是检测结果直观、可判读性高，缺点是检测效率低、数据可重复性较差（郭佳等，2020；马培培等，2020）。实时荧光定量PCR法也可以直接检测肠道特定菌，其优点是检测效率高，但缺点是只能检测指示菌的相对值，尤其是无法定量肠道总菌数的数量级变化（李萌等，2018）。宏基因组测序法可高效地检测饲喂凝结芽孢杆菌对动物肠道大部分细菌种属的影响，但缺点是只能检测细菌丰度值，尤其是无法定量某一特定肠道菌的数量级（高航等，2020）。因此，由于检测方法不同，评估饲用凝结芽孢杆菌对畜禽肠道菌

群影响的报道有一定的差异（赵娜等，2017；Zhen等，2018）。此外，凝结芽孢杆菌添加量、添加方式、实验动物品种、试验日龄、采样部位等因素也会影响饲用凝结芽孢杆菌调控肠道菌群的作用效果（见表2）。

表1 凝结芽孢杆菌体外抑菌实验的抑菌圈直径(DIZ)(牛津杯法，mm)

表1（续）凝结芽孢杆菌体外抑菌实验的抑菌圈直径(DIZ)(牛津杯法，mm)

表2 饲用凝结芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控效果（饲养实验，肠菌数测定）

表2（续）饲用凝结芽孢杆菌对畜禽肠道菌群的调控效果（饲养实验，肠菌数测定）

2 凝结芽孢杆菌抑菌性能的评估

2.1 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道有害菌的抑制作用

等，2018；李静舒等，2020；周倩等，2020）、对沙门氏菌的DIZ值为10.2～18.6 mm（Majeed等，2016；张韵等，2017；赵丽娜，2017；金迅等，2018；周倩等，2020），说明凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌有一定的抑制作用。然而，唯一一篇报道显示：凝结芽孢杆菌LU-B02对大肠杆菌没有抑制作用（刘全永等，2015）。

对应表1和表2汇总了饲喂凝结芽孢杆菌对猪鸡肠道主要有害菌的影响。在肉鸡饲粮中添加凝结凝结芽孢杆菌的报道显示：与对照组（BD）相比，实验组（PD）鸡肠道食糜大肠杆菌数量降低9.5%～100.0%（Hung等，2012；王政等，2016；赵娜等，2017；Zhen等，2018；Wu等，2018）、沙门氏菌数量下降18.5%～60.8%（Zhen等，2018）。赵娜等（2017）使用AV500肉鸡，1～42日龄试验阶段在饲粮中添加0.3×106CFU/g（全价配合饲料）凝结芽孢杆菌，检测42日龄肠道大肠杆菌结果显示：与BD组相比，饲喂凝结芽孢杆菌的PD组肉鸡盲肠大肠杆菌数量下降100.0%。Zhen等（2018）研究1.6×106CFU/g饲用凝结芽孢杆菌对科宝肉鸡肠道菌群的影响，42日龄肠道菌群检测结果显示：与BD组相比，PD组肉鸡盲肠大肠杆菌数量下降65.1%。Wu等（2018）在AA肉鸡饲粮中添加4.0×106CFU/g凝结芽孢杆菌，至42日龄检测肠道大肠杆菌数量的结果也显示PD组肉鸡盲肠大肠杆菌数量比BD组下降了65.1%。此外，只有Zhen等（2018）报道了肉鸡饲喂凝结芽孢杆菌对肠道沙门氏菌数量级降低的效果，这一方面的研究及数据有待于丰富。

在仔猪饲粮中添加凝结凝结芽孢杆菌的报道显示：与BD组相比，PD组仔猪肠道食糜或粪便中大肠杆菌数量降低46.4%～91.7%（王向荣等，2013；黄遵锡等，2017；黄遵锡等，2020）。王向荣等（2013）使用DLY断奶仔猪，在32～67日龄试验阶段，在饲粮中添加0.16×107CFU/g凝结芽孢杆菌，发现PD组粪便中的大肠杆菌比BD组下降了30.9%。随后，黄遵锡等（2017、2020）连续报道，饲喂0.5×107CFU/g和2.0×107CFU/g凝结芽孢杆菌的PD组仔猪粪便、食糜中大肠杆菌比BD组分别下降了46.4%和90.8%。然而，至今没有饲用凝结芽孢杆菌对猪肠道沙门氏菌数量级影响的试验报道，这一方面的研究有待补充。

以上分析表明：肉鸡饲粮添加106CFU/g凝结芽孢杆菌、仔猪饲粮添加106～107CFU/g凝结芽孢杆菌，能够有效降低猪鸡肠道有害菌大肠杆菌，且这一效果与体外牛津杯法评估结果相符。然而，对于沙门氏菌的抑制效果，有待于更多的动物试验证明。

2.2 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的影响

表2汇总了饲喂凝结芽孢杆菌对猪鸡肠道主要有益菌的影响。在肉鸡饲粮中添加凝结凝结芽孢杆菌的报道显示：与BD组相比，PD组鸡肠道食糜乳酸杆菌数量提高55.6%～1 350.0%（Hung等，2012；王政等，2016；Wu等，2018；Zhen等，2018）、双歧杆菌数量提高4.0%～478.9%（Wu等，2018；Zhen等，2018）。Zhen等（2018）使用科宝肉鸡，1～42日龄试验阶段在日粮中添加1.6×106CFU/g凝结芽孢杆菌，检测肠道有益菌的结果显示：肉鸡18日龄，PD组比BD组盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌分别提高113.8%和233.3%；肉鸡42日龄，PD组比BD组盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌分别提高57.3%和8.0%。Wu等（2018）使用AA肉鸡，研究4.0×106CFU/g凝结芽孢杆菌对肠道有益菌的影响，结果显示，肉鸡28日龄，PD组比BD组盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌分别提高154.5%和478.9%；肉鸡42日龄，PD组比BD组盲肠乳酸杆菌、双歧杆菌分别提高55.6%和4.0%。以上结果表明，饲粮添加凝结芽孢杆菌对肉鸡前期肠道有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌有较好的增加效应，但随着肉鸡日龄增加及凝结芽孢杆菌的持续使用，似乎对后期肉鸡肠道有益菌的增加效应减弱，尤其是对双歧杆菌无增加效应。

在仔猪饲粮中添加凝结芽孢杆菌的报道显示，与BD组相比，PD组仔猪肠道食糜或粪便中乳酸杆菌数量提高81.8%～727.6%（王向荣等，2013；黄遵锡等，2017；黄遵锡等，2020）、双歧杆菌提高54.5%（王向荣等，2013）。黄遵锡等（2017、2020）连续报道，饲喂高剂量0.5×107CFU/g和2.0×107CFU/g凝结芽孢杆菌的PD组乳酸杆菌比BD组分别提高了270.8%和727.6%。王向荣等（2013）研究表明，与BD组相比，0.16×107CFU/g较低剂量的凝结芽孢杆菌使仔猪粪便乳酸杆菌数量提高81.8%。以上结果表明，仔猪饲粮添加凝结芽孢杆菌具有显著增加肠道有益菌乳酸杆菌的作用，且这一作用有显著的剂量效应。此外，只有一篇报道显示饲粮添加凝结芽孢杆菌具有增加仔猪肠道有益菌双歧杆菌的作用（王向荣等，2013），因此这一方面的研究有待于完善。

在体外抑菌实验评估方面，迄今为止没有凝结芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌（包括乳酸杆菌、双歧杆菌等）的研究报道，因此这一方面的研究亟待开展。

2.3 凝结芽孢杆菌对饲料及饲料源金黄色葡萄球菌的抑制作用

表1汇总了牛津杯法评估凝结芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑制作用，结果显示凝结芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌抑菌作用的DIZ值范围14.4～20.7 mm（Majeed等，2016；张韵等，2017；赵丽娜，2017；金迅等，2018；周倩等，2020），说明凝结芽孢杆菌对存在于饲料和饲料原料中有害菌金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用。只有刘全永等（2015）研究报道显示，凝结芽孢杆菌LU-B02对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。

2.4 凝结芽孢杆菌对商业饲用益生菌的抑菌作用

我国农业农村部规范的可以在饲料中添加的商业饲用益生菌有34种《饲料添加剂品种目录（2013）》，其中以单一菌或复合菌在饲料及养殖生产中应用较为广泛的包括（唐仁龙等,2018）：芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌）、乳酸菌（屎肠球菌、粪肠球菌）、酵母菌（产朊假丝酵母、酿酒酵母）等。表1汇总了牛津杯法评估凝结芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌抑制作用的研究报道，分析显示：①凝结芽孢杆菌对主要商业饲用益生菌的体外抑菌作用评估缺乏系统性。目前，只有凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌的研究结果（姚晓红等，2015；赵钰等，2015；Fu等，2018；），对当前“替抗”应用较为普遍的地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌等饲用益生菌的抑制研究没有客观数据报道。②采用牛津杯法评估凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌的抑制作用有矛盾。姚晓红等（2015）用牛津杯法评估了3株凝结芽孢杆菌（菌株编号B4、BFS-2、NJ）对枯草芽孢杆菌的抑制作用，结果显示3株凝结芽孢杆菌对枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用。同年，赵钰等（2015）也用牛津杯法得出凝结芽孢杆菌（菌株编号LL1103）对枯草芽孢杆菌有抑制作用的结论。Fu等（2018）再次证明凝结芽孢杆菌（菌株编号L1208）对枯草芽孢杆菌有抑制作用。相反，刘全永等（2015）却报道凝结芽孢杆菌（菌株编号LU-B02）对枯草芽孢杆菌没有抑制作用。进一步分析，2篇饲养试验结果显示：饲用凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌组合饲喂仔猪的生长性能低于单一凝结芽孢杆菌的饲喂效果，这一结果支持了牛津杯法评估凝结芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌有颉颃效应的观点（黄遵锡等，2017；王乙茹等，2018）。

综合以上结果，鉴于凝结芽孢杆菌与其他商业饲用益生菌之间可能存在颉颃效应，因系统地开展凝结芽孢杆菌对其他商业饲用益生菌的抑菌作用研究，才能科学地指导饲料与养殖企业选择凝结芽孢杆菌和其他饲用益生菌的组合应用。

3 展望

借鉴饲用抗生素抑菌促生长的作用效果，在当前“禁抗”的大形势下，饲粮补充凝结芽孢杆菌具有抑制畜禽肠道有害菌、维持肠道菌群平衡的作用，从而改善畜禽健康与生产性能。未来的研究应加快凝结芽孢杆菌体内、体外的系统抑菌性能评估，重点要补充凝结芽孢杆菌对肠道有益菌和其他商业益生菌的可能抑制作用研究，为凝结芽孢杆菌在饲料及养殖业的替抗应用奠定科学基础。