单菌或混菌与植酸酶协同发酵对辣木茎秆粉营养成分和植酸变化的影响

■张玉鹏 李梦梅* 李家明 汪腾蛟 Chidvilaphone Saythong 鄂晓迪 左舒月 沙国新

（1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005；2.广西习缘辣木有限公司,广西南宁530000）

辣木为辣木科辣木属多年生植物，因其根有辛辣味，故而得名辣木[1]。辣木原产于印度，在我国的云南、广东、广西等地均有种植[2]，在广东、福建等经济发达地区在企业和科研机构的推动下，已经形成大规模的种植基地，目前以云南省种植最多，占中国辣木市场的三分之二，并且随着人们对辣木的了解，受到了越来越多农业从事者的青睐。辣木被视为“热带的天然营养素”，整棵树几乎所有部分都具有很高的营养价值。研究表明，辣木除了富含蛋白质、膳食纤维、多种维生素和矿物质外[3]，还富含多糖类、多酚类等抗氧化活性成分[4]，是很好的天然抗氧化剂，摄入后可增强机体对抗自由基的能力，也可预防或延缓疾病发生,具有抗肿瘤、降血脂、降血糖的作用，因此，辣木也被誉为“奇迹之树”[2]。辣木的根、叶、皮、种子、花和豆荚都是可食用的[5]，但是不同部位的营养成分不同，其中蛋白质含量最高的部位是辣木叶，膳食纤维在茎秆中含量最高；叶酸在果实中含量最高，根中的碳水化合物含量均高于其余部位[6]。我国传统蛋白质原料匮乏，严重制约着畜牧业的发展，辣木叶粉具有高蛋白质、低纤维的特点，符合优质蛋白质饲料的标准，因此是一种极具开发利用价值的植物性蛋白源，并且已经有大量报道表明辣木叶代替部分鱼粉、菜籽粕、豆粕饲喂动物可以取得理想的效果。而辣木的茎秆因粗纤维含量较多、蛋白含量不高等原因，国内外对于将辣木茎秆作为新型饲料的开发报道不多。固态发酵是指利用微生物在潮湿的没有自由流动水的固体基质上生长代谢的技术[5]。近几年来采用多菌种复合协同发酵方式是研究的热点，通过微生物之间的共生关系，充分发挥微生物之间协同和互补作用，提高畜禽对秸秆的适口性及消化率，减少饲料成本及环境污染[7]。为了改善辣木茎秆的营养价值，本试验采用菌酶联合对其进行固态发酵。目前在固态发酵蛋白饲料上面应用黑曲霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、植酸酶等比较广泛。研究表明，黑曲霉可产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶[8]；枯草芽孢杆菌不仅自身能够分泌α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，同时也能刺激宿主分泌消化酶并增强其活性[9]；酵母菌细胞不仅富含畜禽生长需要的蛋白质、脂肪、维生素等多种营养物质，而且还可以产生多种酶类，降解饲料中的抗营养因子，提高饲料利用率[10]；植酸酶可以催化植物中的植酸及其盐类，将植酸或其盐类降解为能被畜禽利用的肌醇和无机磷[11]。本试验以辣木茎秆粉为基质，探讨黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植酸酶单独或菌酶协同发酵时对辣木茎秆营养成分变化的影响，旨在为开发新型辣木饲料提供新的方法和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 辣木茎秆粉

辣木茎秆粉由广西习缘辣木有限公司提供。

1.1.2 菌株和酶

黑曲霉(FCCC 114002)、酿酒酵母(ATCC 26603)为实验室保存菌种；枯草芽孢杆菌（FSCC 115037）与植酸酶（5 U/mg）均购自上海谷研生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

浓硫酸、氢氧化钠、硼酸、硫酸铜、丙酮、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、三甘醇、无水亚硫酸钠、十六烷三甲基溴化铵等均为分析纯，均购自北京索莱宝科技有限公司。PDA培养基、LB培养基购自南宁五棵松生物试剂经营部。

电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；K9860全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；A200i半自动纤维分析仪,美国ANKOM-上海瑞望仪器设备有限公司；恒温水浴锅（HH-2），常州普天仪器制造有限公司。紫外分光光度计（SP-756P），上海光谱仪器有限公司；Centrifuge 5804R离心机,德国艾本德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

枯草芽孢杆菌LB液体培养基35℃培养24 h。黑曲霉和酿酒酵母接种于PDA固体培养基中，30℃恒温培养3 d。

1.3.2 种子液的制备

将酿酒酵母菌和黑曲霉接种于PDA固体培养基中，30℃无菌恒温培养箱内培养3 d，待其长满整个培养基，用无菌纯水冲洗，将其浓度调节为1×108CFU/mL。枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基35℃，250 r/min条件下恒温培养48 h，用无菌水稀释至浓度为1×108CFU/mL。

1.3.3 辣木茎秆粉发酵固态发酵的制备

称取120 g辣木茎秆粉作为发酵基质，植酸酶（Z）的添加量为180 U/g，黑曲霉(H)、枯草芽孢杆菌（K）、酿酒酵母（N）按10%添加量（接种比例为1∶1和1∶1∶1）与植酸酶（添加量为180 U/g）组成双菌加酶组和三菌加酶组。对照组则添加等量的无菌水，其他发酵条件保持一致，以70%含水量在无菌恒温培养箱中30℃恒温发酵10 d，分别在第1、2、4、6、8、10 d取样。菌种和植酸酶的组合方式见表1。

表1 菌种和植酸酶的组合方式

1.4 成分的测定

1.4.1 营养成分的测定粗脂肪(EE)含量的测定采用GB/T 6433—2006《饲料中粗脂肪的测定》；粗蛋白(CP)含量的测定参考GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维参考Van Soest法[12]测定。

1.4.2 植酸的测定

参考李镇刚等[13]的方法测定植酸含量。

1.5 数据的统计分析

试验数据采用Microsoft Excel软件对数据进行整理，采用SPSS 24.0进行差异显著性分析，试验结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05为差异显著标准。

2 结果与分析

2.1 酶菌协同发酵对粗蛋白含量的影响（见表2、图1）

表2 酶菌协同发酵对粗蛋白含量的影响（干物质,%）

如表2和图1所示，在整个固态发酵过程中，各组的粗蛋白含量都呈增加的趋势。从表2中可以看出，从发酵的第6 d开始，除T1组外，单菌或混菌与植酸酶协同发酵时辣木茎秆粉中的粗蛋白含量均显著高于对照组（P＜0.05）；在发酵的第8 d开始T5、T6、T7、T8组粗蛋白含量要显著高于CK、T1、T2、T3、T4组，这说明混菌与植酸酶协同发酵要优于单菌与植酸酶发酵；单独添加植酸酶对粗蛋白含量变化与对照组差异不显著（P＞0.05），这说明植酸酶对粗蛋白含量的提升没有太大的影响；从整个发酵过程来看，发酵的前8 d，各个处理组粗蛋白含量呈上升趋势，到第10 d时，上升趋势下降，这说明在发酵的第8 d基本已达到最佳发酵时间。

2.2 酶菌协同发酵对酸性洗涤纤维含量的影响（见表3、图2）

图1 酶菌协同发酵对粗蛋白质含量的影响

表3 酶菌协同发酵对酸性洗涤纤维含量的影响（干物质,%）

图2 酶菌协同发酵对酸性洗涤纤维含量的影响

由表3和图2可知，所有试验组的酸性洗涤纤维都呈下降趋势。在整个发酵过程T1、T4组和对照组相比差异不显著（P＞0.05），这说明植酸酶和酿酒酵母单独或协同添加对酸性洗涤纤维含量的降低无明显作用。在发酵的第6 d开始，T2、T3、T5、T6、T7、T8组酸性洗涤纤维含量均显著低于对照组（P＜0.05），这说明黑曲霉、枯草芽孢杆菌单菌或混菌与植酸酶协同发酵时能很好地降低酸性洗涤纤维的含量。在发酵的前8 d酸性洗涤纤维的含量呈快速下降趋势，在第10 d时，下降趋势变得缓慢，这说明在发酵的第8 d时达到了很好的发酵效果。

2.3 酶菌协同发酵对中性洗涤纤维含量的影响（见表4、图3）

表4 酶菌协同发酵对中性洗涤纤维含量的影响（干物质，%）

图3 酶菌协同发酵对中性洗涤纤维含量的影响

如表4和图3所示，在整个发酵过程T1、T4组和对照组相比差异不显著（P＞0.05），这说明植酸酶和酿酒酵母单独或协同添加对中性洗涤纤维含量的降低无明显作用。在发酵的第8 d开始，T2、T3、T5、T6、T7、T8组中性洗涤纤维含量均显著低于对照组（P＜0.05），这说明黑曲霉、枯草芽孢杆菌单菌或混菌与植酸酶协同发酵时能很好地降低中性洗涤纤维的含量。在发酵的前8 d中性洗涤纤维的含量呈快速下降趋势，在第10 d时，下降趋势变得缓慢，这说明在发酵的第8 d时达到了最佳状态。

2.4 酶菌协同发酵对粗脂肪含量的影响（见表5、图4）

表5 酶菌协同发酵对粗脂肪含量的影响（干物质，%）

图4 酶菌协同发酵对粗脂肪含量的影响

由表5和图4可以看出，随着发酵的进行粗脂肪的含量呈上升趋势。在发酵的前6 d各处理组粗脂肪含量和对照组粗脂肪含量无显著差异（P＞0.05），第8 d时T6、T7、T8组粗脂肪的含量显著高于CK、T1、T2、T3、T4、T5组（P＜0.05）。在发酵到第10 d时各试验组粗脂肪含量增加幅度变得缓慢，并且有的组粗脂肪含量还有略微下降趋势，这可以说明在发酵的第8 d粗脂肪的含量提高处于一个比较佳的时间。

2.5 酶菌协同发酵对植酸含量的影响（见表6、图5）

由表6和图5可知，植酸的含量呈下降趋势，自发酵的第6 d开始各处理组植酸的含量均显著低于对照组（P＜0.05）；在发酵的10 d时，T5、T6、T7、T8组植酸的含量显著低于CK、T1、T2、T3、T4组，这说明混菌与植酸酶协同发酵要优于单菌与植酸酶协同发酵；在发酵的前8 d植酸含量的下降趋势比较明显，到第10 d时植酸含量的下降趋势呈缓慢状态，这说明发酵的第8 d是最佳发酵时间。

3 讨论

3.1 多菌联合固态发酵的优势

用微生物固态发酵技术提高饲料品质是近几年来饲料行业研究的热点[14]。有大量报道多菌优于单一菌种发酵，这是因为单菌发酵时微生物的代谢产物大量积累会反馈阻遏相关酶类的合成，而多菌混合发酵时，各种微生物间大多具有代谢协调作用，从而解除反馈阻遏作用[5]。孙旸等[15]采用混菌将玉米秸秆发酵后粗蛋白的含量从3%～5%提高到15.471%；陈庆森等[16]用多菌种发酵玉米秸秆后粗蛋白利用率达23%以上，粗纤维利用率达70%；白春艳[17]混菌发酵高粱秸秆后滤纸酶活性达到了389.89 U/mL，比单一菌提高了14.30%；刘纪成等[7]对花生秸秆多菌混合固态发酵后，粗蛋白含量提高了53.39%，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别下降了14.66%和21.53%；侯敏等[18]采用菌酶协同发酵棉秆后中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别下降了4.61%、8.01%，纤维素降解率达到了25.62%；石鸿辉等[5]对辣木茎叶粉混菌固态发酵后粗蛋白从19.84%提高到29.29%，植酸的含量从55.15mg/g降低到46.91mg/g。

表6 酶菌协同发酵对植酸含量的影响（干物质，mg/g）

图5 酶菌协同发酵对植酸含量的影响

3.2 菌酶协同固态发酵的优势和必要性

添加菌和酶均可改善饲料发酵品质。微生物发酵依靠各种菌所产生的代谢产物在合成酶的作用下来提高饲料的营养价值；酶作为一种具有特殊作用蛋白质，可直接添加到饲料中来降低饲料中的抗营养因子，而且在发酵过程中可以以一种催化剂的形式优化发酵工艺。本试验用黑曲霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌单菌或混菌与植酸酶对辣木茎秆粉进行固态发酵后，测定辣木茎秆粉营养成分和植酸含量的变化。结果表明随着发酵时间的延长粗蛋白含量呈上升趋势，并且从发酵的结果来看T5、T6、T7、T8组两菌或三菌和植酸酶协同发酵的处理组要明显的优于其他试验组，这与曾李等[19]的研究结果相似，这是因为混菌组合发酵时自身不仅可以产生丰富的蛋白酶系，而且自身还可以产生更多的菌体蛋白，从而达到饲料原料中粗蛋白含量的提高。ADF、NDF的含量随着发酵时间的延长也不断的下降，并且T5、T6、T7、T8组效果优于其他组，这是因为黑曲霉和枯草芽孢杆菌都能产生大量的纤维素酶，并且当黑曲霉和枯草芽孢杆菌共同和酿酒酵母培养后可以生成更加完整的纤维素酶系统，这一结果与Kalyani等[20]研究结果相似。在所有处理组中植酸的含量随着发酵时间的延长都呈下降趋势，这是因为植酸酶可以催化植物中的植酸[12]，从而降低植酸的含量，在本试验中两菌或者三菌与植酸酶协同发酵降解植酸时效果更佳，这可能是因为植酸酶与黑曲霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母产生的酶系有叠加作用。粗脂肪的含量随发酵时间的延长升高，且在发酵第8 d时T6、T7、T8组要显著高于CK、T1、T2、T3、T4、T5组；在发酵第10 d时，T5、T6、T7、T8组显著高于CK、T2组，和T1、T3、T4组比较，粗脂肪含量也有升高，但差异不显著。这是因为黑曲霉和枯草芽孢杆菌都能分泌大量的脂肪酶，这也与张熙等[21]、Feng等[22]的研究结果一致。

3.3 菌酶协同固态发酵条件的优化

在发酵过程中不同微生物最适宜的生长环境也是不尽相同的(如接种量、含水量、温度、pH及发酵时间等)。菌种接种量直接影响菌种的多项生物学特性，当接种量过大时，菌体生长速度过快，营养物质消耗过快，释放大量热量，温度升高；当接种量过小时，发酵静止时间长，感染细菌概率增加，最终影响发酵品质。水是微生物生长代谢的必需养分，为微生物生长提供营养和代谢的水环境，含水量过低，不利于菌体的生长、产酶；含水量过高，将增加氧的传质阻力和杂菌污染的可能性。邱鑫等[23]以温度、时间相同，用50%、80%、100%不同的含水量的条件下发酵菜籽饼，结果表明100%含水量效果最佳。每种微生物都有适宜的生长温度，过高或过低都会影响微生物生长，其次温度能够直接影响微生物源蛋白酶和纤维素酶活性，从而影响发酵效果，微生物发酵还是一个代谢产热过程，温度过高时还会导致发酵饲料内部产热过快，热量聚集，不利于微生物生长。固态发酵中，发酵时间也是一个重要的参数，发酵时间过短，微生物不能充分利用碳源生长，微生物代谢不能达到最佳值；发酵时间过长，菌体易发生自溶，且易造成杂菌污染。莫重文[24]研究用米曲霉和啤酒酵母混合发酵豆粕24～84 h，结果表明随发酵时间延长，蛋白质含量显著增加，但是在72 h时增加速度变慢。pH值直接影响菌体细胞膜上的电荷性质，正常细胞质上的电荷有助于营养物质的吸收，当细胞膜上电荷性质受到外界氢离子浓度影响发生改变时，微生物吸收基质营养物质机能则发生改变[25]。微生物发酵是一个复杂的生物反应过程，除受微生物自身的生物学特性影响外，接种量、含水量、温度、pH及发酵时间等对发酵都有很大的影响。

在本试验中黑曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母按10%添加量（接种为1∶1和1∶1∶1）与植酸酶（添加量为180 U/g）混合添加，70%含水量，30℃恒温发酵10 d的发酵条件下得到在发酵第8 d时效果最佳。随着将来研究的深入和发酵条件的优化，还可再缩短发酵时间，提高生产效益。

4 结论

本试验从发酵后辣木茎秆粉营养成分与植酸含量的变化来评价单菌或混菌与植酸酶协同发酵的最佳组合和最佳发酵天数，结果发现两菌或三菌与植酸酶协同发酵时效果优于单菌。综合考虑最佳的组合方式是植酸酶+枯草芽孢杆菌+黑曲霉+酿酒酵母，发酵时间是8 d。