角蛋白酶水解豆粕参数优化对营养价值的提升

■陈 锐 周广平 黄 艳 马诗淳 邓 宇

(农业农村部沼气科学研究所，农业农村部农村可再生能源开发利用重点实验室，四川成都610041)

豆粕是大豆提取豆油后的一种副产品，其粗蛋白质含量高，必需氨基酸含量均衡[1]，是一种重要的植物性蛋白饲料来源。但豆粕含有的抗营养因子，如胰蛋白酶抑制因子、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和低聚糖等降低了豆粕的营养可利用率[2-4]。酶解豆粕能有效降低豆粕中的抗营养因子，改善豆粕的营养价值[5]。豆粕经过酶解后，产生大量小肽、游离氨基酸、大豆异黄酮[6]等有益物质，可有效改善豆粕的营养性和适口性，使其不仅更易被动物肠道吸收，还能增强动物肠道的免疫能力[7]。

豆粕中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白中含有大量二硫键[8]，增加了酶解难度。角蛋白酶是一组具有广泛pH和温度范围的蛋白酶类，它能够降解包括羽毛、羊毛、指甲、头发等富含二硫键结构的角蛋白[9-11]。因此有研究通过在玉米-豆粕型饲料中添加角蛋白酶来降低大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量，以及提高粗蛋白、游离氨基酸在回肠中的消化率[12-14]。

嗜热厌氧杆菌（Keratinibaculum paraultunense）KD-1是本课题组分离的一株能够高效降解羽毛角蛋白的菌株，该菌能在24 h内完全降解羽毛角蛋白[15]；其分泌的胞外角蛋白酶具有高活性、较宽的温度和pH范围，最适温度为80℃，最适pH值为10.0[16]。基于此，本课题组提出通过KD-1产生的角蛋白酶酶解豆粕，以达到降低豆粕中抗营养因子，提高营养价值的目的。本研究以粗蛋白、酸溶蛋白、游离氨基酸、多种抗营养因子为检测指标，在单因素试验的基础上通过正交试验对酶解豆粕的条件进行优化，以此来确定KD-1角蛋白酶酶解豆粕的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 菌种

嗜热厌氧杆菌（Keratinibaculum paraultunense）KD-1为中国厌氧微生物保藏中心（CCAM）保藏。

1.2 材料

鸡毛购于四川广汉市正旺蛋白粉厂，自来水清洗后晒干备用。豆粕购买于成都市新津县某批发市场，粉碎后过1mm孔径筛，置于干燥处储存。

1.3 基础培养基、培养方法及粗酶液制备

对黄艳等[17]的培养基配方作进一步优化，将初始pH值改为8.5，羽毛浓度改为2%（W/V）。所有培养基和试剂均采用Hungate厌氧操作技术[18]配制，配制好后121℃灭菌30 min。将KD-1种子液接种于羽毛发酵培养基中，55℃厌氧培养45 h后，取发酵液，于4℃下10 000 r/min离心15min，收集上清液，得到粗酶液。

1.4 试验设计

1.4.1 酶解豆粕反应的温度优化

将30 g豆粕和300 mL粗酶液加入500 mL螺口试剂瓶，在65、70、75、80、85、90℃下进行高温酶解；以添加灭活后的粗酶液（121℃高压蒸汽灭活30 min）作为对照组。酶解过程中定时取样，监测酸溶蛋白含量变化，分析酶解温度对豆粕品质的影响。

1.4.2 酶解豆粕反应的底物浓度和时间优化

分别添加10%、20%、30%、40%、50%（W/V）的豆粕在300 mL粗酶液中，以灭活后的粗酶液组为对照组，在最佳酶解温度下，分别酶解0、1、2、3、4、5 h后取样，监测酸溶蛋白含量变化，分析酶解底物浓度和时间对豆粕营养价值的影响。

1.4.3 正交试验优化酶解豆粕条件

选择酶解温度（80、85、90℃），底物浓度（10%、15%、20%）以及酶解时间（1、2、3 h）作为正交试验的因素，采用L9(34)正交表进行3因素3水平的正交试验，各因素水平依据以上单因素试验结果设置，见表1。

表1 正交试验设计

1.4.4 豆粕与酶解豆粕的营养成分和抗营养因子差异

最佳酶解条件下处理豆粕后，检测豆粕和酶解豆粕中粗蛋白、酸溶蛋白、游离氨基酸等营养物质含量的差异，以及大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖、脲酶等6种抗营养因子含量的差异。

1.5 测定方法

酸溶蛋白测定参照张雪旺[19]的方法，并略作修改，将样品与双缩脲试剂（雷根生物，批号：PT0003-500mL）的反应体系缩小至2mL。使用总氨基酸（TAA）测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：A026）测定豆粕中游离的总氨基酸浓度。粗蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016第一法《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子含量测定方法参照ELISA检测试剂盒（优选生科，批号分别为：CK-E41508M，CKE41506M，CK-E41517M）说明书进行。棉籽糖、水苏糖含量使用HPLC测定。脲酶测定参照GB/T 8622—2006《饲料用大豆制品中脲酶活性的测定》[20]。

1.6 数据分析

用SPSS 22.0对正交试验结果进行LSD多重比较检验，比较组间各因素之间的差异性（P＜0.05为显著）。

2 结果与分析

2.1 酶解豆粕反应的最佳温度优化(见图1)

试验结果表明温度是影响豆粕酶解的因素之一，在酶解温度65～85℃范围内，豆粕中的酸溶蛋白含量随着温度增加而上升；酶解温度为85℃时，酸溶蛋白含量达到最大，为30.23%；酶解温度为90℃时，酸溶蛋白含量略微下降了2.5%，但与85℃时的含量差异并不显著（P＞0.05）。因此，综合能量损耗和酸溶蛋白含量来判断，85℃是KD-1角蛋白酶酶解豆粕的最佳温度。

图1 酶解温度对豆粕酸溶蛋白含量的影响

图2 底物浓度和酶解时间对豆粕酸溶蛋白含量的影响

2.2 酶解豆粕反应的最佳底物浓度和时间优化(见图2)

依据不同的底物浓度（10%、20%、30%、40%、50%（W/V）将豆粕和粗酶液混合均匀后置于85℃水浴锅中进行高温酶解，每间隔1 h取样测定酸溶蛋白含量。试验数据表明[图2(A)]每克豆粕所能产生的酸溶蛋白含量随着酶解底物浓度增加而降低，当底物浓度为10%时，酸蛋白含量是最高的，为25%，较之底物浓度为20%、30%、40%、50%的试验组分别增加了47%、108%、78%和127%，因此判断10%的底物浓度是酶解豆粕的最佳比例。

时间对豆粕酶解的影响如图2(B)所示，底物浓度为10%时，在前2 h内，酸溶蛋白含量随着时间增加而上升；酶解2 h时，酸溶蛋白含量达到最高；2 h后酸溶蛋白含量开始下降，这可能是因为当酶解时间过长时，酸溶蛋白的生成速率小于分解速率，因而酸溶蛋白含量呈降低趋势。因此2 h是酶解豆粕产酸溶蛋白的最佳时间。

综合以上3个单因素试验结果可知，不同酶解温度、时间和底物浓度均能对豆粕酶解产生影响；KD-1角蛋白酶酶解豆粕的适宜条件为：底物浓度10%（W/V），酶解温度85℃，酶解2 h。

2.3 正交试验优化的最佳酶解豆粕条件

对酶解豆粕条件进行正交优化，试验结果见表2。极差分析结果表明，各因素影响豆粕酶解产酸溶蛋白的主次顺序为B＞A＞C，即底物浓度对豆粕酶解的影响最大。依据各因素水平的均值K1、K2、K3得到KD-1角蛋白酶酶解豆粕的最佳组合为B1A2C3，即是底物浓度10%，酶解温度85℃，酶解3 h；但在试验设计中并未有这一组合，因此重新在该条件下酶解豆粕后，测定酸溶蛋白含量。

表2 正交优化试验结果极差分析

原料豆粕、正交试验中的组合9以及酶解豆粕最优组合B1A2C3的酸溶蛋白含量分别为3.83%、26.99%、28.61%（图3）。在最优条件B1A2C3下，KD-1角蛋白酶酶解豆粕的酸溶蛋白含量是原料豆粕的7.5倍。对正交试验结果进行方差分析，仅底物浓度这一因素的3水平之间存在显著差异（见表3），酶解温度和酶解时间的各水平之间差异并不显著。

图3 原料豆粕、正交试验组合9、最优组合的酸溶蛋白含量

2.4 豆粕与酶解豆粕的营养成分和抗营养因子差异

表3 正交优化试验酸蛋白方差分析结果

在豆粕酶解的最佳条件下，分别测定酶解豆粕和原料豆粕的营养成分和抗营养因子差异。结果如表4所示，与豆粕相比，酶解豆粕的各项指标与之均有显著差异（P＜0.05）。

豆粕经酶解后，粗蛋白质含量提高了9.13%，酸溶蛋白、游离氨基酸含量分别是原来的7.5倍、9.7倍；大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子、棉籽糖、水苏糖等抗营养因子含量分别下降了57.19%、59.35%、59.27%、49.38%、54.43%，经酶解后的豆粕中没有检测到脲酶的存在。本试验结果与其他发酵豆粕中抗营养因子含量下降的比例基本一致[21]。

3 讨论

3.1 角蛋白酶对豆粕中酸溶蛋白含量的影响

表4 豆粕与酶解豆粕的营养成分和抗营养因子差异

酸溶蛋白含量变化可以反映豆粕中大分子蛋白被水解的情况，因此在饲料生产中多用来作为检测发酵豆粕小肽含量的一个指标[22]。董伟洁等[23]利用耐酸产蛋白酶芽孢杆菌在最优条件下固体发酵豆粕30 d后，酸溶蛋白相对含量提高了127.6%。刘延杰等[24]在pH值为9.0、50℃条件下用角蛋白酶酶解豆粕6 h后，其可溶性蛋白和酸溶蛋白含量均显著增加，产生分子量＜5 000 Da的小肽占比83.71%。在本试验中，经角蛋白酶酶解3 h后的豆粕，酸溶蛋白相对含量提高了647.0%，占到了粗蛋白含量的58.54%，远高于农业农村部发布的发酵豆粕质量标准（NY/T 2218—2012）[25]中酸溶蛋白相对含量不得低于8%的规定。饲料中小肽含量的增加可以提高饲养动物对营养的吸收利用率，促进肠道的早期发育并提高免疫能力[7，26]。因此酶解豆粕中酸溶蛋白含量大幅度增加对提升饲料的功能和价值是有利的。

3.2 角蛋白酶对豆粕中抗营养因子的影响

豆粕抗原蛋白中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白会对断奶仔猪的肠道形态和免疫功能造成损害[27]；胰蛋白酶抑制因子会降低动物肠道中多种消化酶的活性[2]；大量的寡糖也容易引起动物的腹胀和腹泻[28]，因此通过酶解作用来降低豆粕中的抗营养因子，从而促进动物的健康生长是一个有效途径。张忠鑫等[29]试验结果表明在同等酶活下，不同蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的降解程度有较大差异。于海涛等[30]试验结果显示角蛋白酶体外酶解豆粕麦麸混合物可以降低豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量。本试验中，经KD-1角蛋白酶酶解后的豆粕，6种抗营养因子含量均显著下降，极大地改善了豆粕的风味和营养品质。

4 结论

①豆粕经KD-1角蛋白酶酶解后，营养价值显著增加，抗营养因子显著下降，功能得到了改善，提高了豆粕的饲料价值。

②KD-1角蛋白酶由厌氧微生物产生，生产成本低，角蛋白酶活性高，酶作用温度及效率均较高，生产过程不易污染，具有良好的应用前景。