精氨酸对尼罗罗非鱼生长、脂肪蓄积、血清生化指标及肝脏多胺代谢途径相关基因表达的影响

■程炜轩 许国焕 张 丽 李 薇 印遇龙

（1.广东省科学院微生物研究所，广东广州510070；2.华南应用微生物国家重点实验室，广东广州510070；3.广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东广州510070；4.广东省科学院，广东广州510070；5.广东碧德生物科技有限公司，广东广州510663；6.华中农业大学水产学院，湖北武汉430070）

尼罗罗非鱼(Oreochromis nilotica)肉质鲜美，抢食力强，生长迅速，已被多个国家和地区广泛引入，是联合国推荐养殖的优质水产养殖品种。2019年，我国罗非鱼养殖产量已达164.17万吨，约占世界总产量的40%，其出口量位列我国水产品前三位[1]。在集约化养殖过程中，尼罗罗非鱼容易出现肝脏脂肪不正常蓄积的现象，导致营养性脂肪肝。尼罗罗非鱼患上脂肪肝，除了影响鱼肉品质外也会造成肝脏受损、免疫力降低、生长迟缓以及死亡率升高等后果[2]。

对于鱼类，精氨酸是必需氨基酸之一，参与体内蛋白质合成、尿素循环等。在鱼类生长、心血管、内分泌、免疫等方面起着重要作用[3]。另外，多胺代谢途径中的关键酶——鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase,ODC)活性依赖于底物L-精氨酸，在精氨酸酶作用下，该底物可转化为鸟氨酸，进入多胺合成[4]。多胺通过调节乙酰辅酶A(acetyl-CoA)水平控制脂肪蓄积，而且在亚精胺/精胺-N1-乙酰基转移酶(spermidine/spermine-N1-acetyltransferase,SSAT)作用下生成精胺和亚精胺，精胺和亚精胺可通过AMP循环影响脂解和葡萄糖转运[5]。饲料中添加28.8～37.4 g/kg体重的精氨酸，可促使大西洋鲑肝脏中ODC的mRNA表达上调，同时促使多胺降解acetyl-CoA的限速酶SSAT以及长链脂肪酸β氧化的限速酶肉碱棕榈酰转移酶-1(Carnitine palmitoyl transferase-1,CPT-1)的基因表达量上升，从而降低肝脏脂肪的蓄积[6]。此外，研究证明，精氨酸可以改变鱼体内不同部位的脂肪含量[7]。乙酰辅酶A羧化酶（AcetylCoAcarboxylase,ACC）催化生物体内由乙酰辅酶A转变成丙二酰辅酶A的化学反应,制约着脂肪酸合成第一阶段的速度。脂肪酸合酶（Fattyacidsynthase,FAS）催化乙酰辅酶A以及丙二酰辅酶A合成脂肪酸，是体内脂肪合成的关键酶[7]。

使用氨基酸途径调节鱼体内脂肪蓄积，是安全且高效的方法。但是对于尼罗罗非鱼，相关机制未明而且研究基础尚不足以支持其应用。本研究测定并计算尼罗罗非鱼生长指标，测定血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、胆汁酸(TBA)，测量肌肉脂肪含量(MFC)和肝脏脂肪含量(LFC)，检测肝脏多胺代谢途径相关基因表达量。以期探明精氨酸对尼罗罗非鱼生长、血脂以及多胺代谢、脂肪代谢途径中相关基因表达等的影响，为精氨酸调节鱼类脂肪代谢，以及实际生产中应用精氨酸减少鱼肝脏脂肪蓄积提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼购于广东省罗非鱼良种场(广州市番禺区大稳村)，购回的尼罗罗非鱼用基础饲料定时定量投喂，驯养在3m×2m、水深1.5m的水泥池中。

试验饲料是在基础饲料[8](粗蛋白含量约为36.27%，粗脂肪含量约为4.29%)中分别添加晶体精氨酸0、1.5%和2.5%，配制出三种饲料(见表1)，按照GB/T 18246—2000对饲料中氨基酸的测定方法实测3种饲料中的精氨酸含量分为2.21%、3.58%和4.46%，分别记为对照(CL)组、高精氨酸(LA)组和低精氨酸(HA)组。

1.2 试验方法

试验设计：使用CL组饲料驯养14d以上，禁食1d，用MS-222轻微麻醉后，选取360尾健康、体格均匀、初始体重为20g左右的幼鱼，随机分配到9个圆形玻璃纤维养殖缸中，玻璃缸直径1.5m，水深1m，每组3平行，每平行40尾鱼，适应1d后，待鱼能正常摄食饲料且摄食量不变后开始正式试验，按组分别投喂CL、LA组和HA组饲料60d，每天在09:00、12:00、18:00各投喂1次，投喂量为饱食量80%，2周调整一次投喂量。饲养期间，水温（30±1）℃，pH值7.0，溶解氧8.0mg/L以上，氨氮浓度小于0.2mg/L。每2d换水1次，水源为经曝气后的自来水，换水量为原来水量的1/4～1/3，换水的同时抽去残饵和粪便。在正式试验开始后的30d以及60d时分别对每缸尼罗罗非鱼随机采样，每次每缸各取10尾，称重、测量鱼体长、尾静脉采血，血清用于检测生化指标，冰盘上解剖并剥离肝脏、背部肌肉，将肝脏称重记录，肌肉和肝脏-80℃保存，用于检测生化指标或脂肪含量。30d和60d时分别从每缸再另取7尾鱼冰盘上解剖取肝脏，存于液氮中用于基因指标检测。

表1 试验饲料配方及营养水平(%)

增重率(WGR，%)=[(Wt-W0)/W0]×100

特定生长率(SGR，%/d)=（lnWt-lnW0）/T×100

饲料系数(FCR)=WF/(Wt-W0)

肝体比(HIS,%)=WL/Wt×100

肥满度(g/cm3)=Wt/Lt3×100

式中：W0——试验开始时鱼体质量(g);

Wt——试验结束时鱼体质量(g);

WF——试验结束时摄食的饲料总质量(g)；

WL——试验结束时肝脏质量(g)；

WN——试验结束时内脏质量(g)；

Lt——试验结束时鱼体长(cm)；

T——试验天数(d)。

血清生化指标检测：将采集的血液样本在室温下静置30 min，转入4℃冰箱放置3 h后4 000 r/min离心10 min，抽取上层血清，同缸鱼血清合并为1份，4℃存放，用于三酰甘油(TG)、总胆固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、胆汁酸(TBA)的活性检测，上述指标检测所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

烘干样品后用索氏抽提法抽取脂肪后计算肝脏和肌肉脂肪含量。

基因指标检测：cDNA第一链合成与荧光定量PCR，7尾试验鱼的肝脏用液氮速冻保存。总RNA提取使用Trizol试剂进行，逆转录过程则使用TaqMan Gold RT-PCR Kit(USA)，取500 ng RNA按以下程序进行：25℃10 min，60℃48 min，95℃5 min，得到的cDNA于-20℃保存，荧光定量PCR则使用实时荧光定量仪Lightcycler 480(Switzerland)，按以下程序测定：以β-Actin作为参照基因，使用相应引物(见表2)，程序为95℃5 min，然后95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s一个循环，共45个循环。完成后读取数据，数据的处理按统计学方法进行。

表2 RT-PCR所用引物

1.3 数据统计与分析

采用ΔCt法进行目标基因荧光定量分析；应用SPSS 11.5软件对获得的试验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s多重比较，所有数据以“平均值±标准差”来表示，P＜0.05时表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 精氨酸饲料对尼罗罗非鱼生长和内脏指数的影响（见表3）

表3 精氨酸对尼罗罗非鱼生长和内脏指数的影响

由表3可知，各组间尼罗罗非鱼的末均重、增重率、特定生长率、饲料系数、成活率均无显著性差异（P＞0.05）。肝体比和肥满度方面，HA组显著高于CL组、LA组（P＜0.05）。

2.2 精氨酸对尼罗罗非鱼血清生化指标的影响（见表4）

由表4可知，试验进行30 d时，HA组和LA组罗非鱼血清ALT、AST含量均显著低于CL组(P＜0.05)，HA组罗非鱼血清LDH显著低于CL、LA组(P＜0.05)；经过60 d饲喂试验后，HA组和LA组罗非鱼血清ALT含量和AST含量显著高于CL组(P＜0.05)；HA组的LDH含量和ALP含量显著高于CL组、LA组(P＜0.05)；TBA方面，30 d和60 d各试验组与CL组间无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 精氨酸对尼罗罗非鱼脂肪指标的影响（见表5）

表4 精氨酸对尼罗罗非鱼血清生化指标的影响

表5 精氨酸对尼罗罗非鱼脂肪指标的影响

由表5可知，30 d时，HA组和LA组尼罗罗非鱼血清T-CHO、TG和LFC均显著低于CL组（P＜0.05），而HA组和LA组尼罗罗非鱼血清HDL含量则显著高于CL组（P＜0.05）；经过60 d饲喂试验后，HA组和LA组罗非鱼血清T-CHO、TG、LDL、MFC含量和LFC含量显著高于CL组（P＜0.05）；而HA组和LA组罗非鱼血清HDL含量均显著低于CL组。

图1 试验30 d时精氨酸对尼罗罗非鱼肝脏多胺及脂肪代谢途径相关基因表达量的影响

2.4 精氨酸对尼罗罗非鱼肝脏多胺途径相关基因表达的影响（见图1～图2）

由图1可知，30 d时，HA组的尼罗罗非鱼肝脏中的ODC与SSAT基因表达量显著高于CL、LA组（P＜0.05），LA组与CL组差异不显著（P＞0.05）。CPT-1基因表达量，LA组高于CL组，但差异不显著（P＞0.05），各组间ACC与FAS基因表达量无显著性差异（P＞0.05）。

图2 试验60 d时精氨酸对尼罗罗非鱼肝脏多胺及脂肪代谢途径相关基因表达量的影响

由图2可知，60 d时，HA组和LA组的尼罗罗非鱼肝脏中的ODC与SSAT基因表达量显著低于CL组（P＜0.05），而各组间CPT-1、ACC与FAS基因表达量无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 不同精氨酸含量饲料投喂对尼罗罗非鱼生长及血清生化指标的影响

与哺乳类动物不同，精氨酸对于鱼类来说是必需氨基酸，因为鱼类缺少将谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸转化为瓜氨酸的途径[9]。本试验对尼罗罗非鱼投喂不同精氨酸含量的配合饲料，各处理组尼罗罗非鱼生长速度无显著性差异，这一结果与类似试验的研究结果相近[10]。原因是饲料中多余的精氨酸并不能提高肠道对精氨酸的吸收能力、氨基酸代谢和利用效率[11]。当精氨酸含量达28.8 g/kg以上时，大西洋鲑（Salmo salar）也出现了肝体比和肥满度显著降低的现象[11]。而尼罗罗非鱼则在饲料中精氨酸含量为22.1～35.8 g/kg时，肝体比和肥满度出现同样现象，但饲料中精氨酸含量达到44.6 g/kg时，肝体比和肥满度则上升。说明饲料中精氨酸含量不同，可以影响养殖鱼类肝体比和肥满度。

血清中转氨酶含量经常作为生物标记来判断肝脏的损伤程度，脂肪肝较严重时将导致肝细胞被破坏或细胞膜通透性增加，从而导致肝脏中的转氨酶，如ALT、AST、LDH和ALP释放到血液中[12]。从处理时间上看，投喂高精氨酸含量饲料30 d后，尼罗罗非鱼血清ALT、AST含量和LDH含量显著降低，而经过60 d处理后，其趋势则相反。说明短时间使用高含量精氨酸含量饲料能保护肝脏，但是当饲喂时间延长，多余的氨基酸转化为脂肪，对脂肪肝的生成有促进作用，从而可能对肝细胞造成损伤或导致细胞膜通透性增加[13]。

3.2 不同精氨酸含量饲料投喂对尼罗罗非鱼脂肪指标的影响

HDL主要用来运输或移走肝脏和血液中的胆固醇，血液中HDL和LDL总量较为稳定，HDL含量增加往往造成LDL含量降低。另一方面，血液中胆固醇、三酰甘油含量往往与肝脂肪积累量有关[14]。经过30 d饲喂试验后，HA组和LA组尼罗罗非鱼血清T-CHO、TG含量和LFC含量均显著低于CL组，而血清HDL含量则显著高于CL组，显示肝、血清脂肪含量有下降趋势，而且帮助肝脂肪运输的HDL含量仍保持较高水平。但是经过60 d饲喂试验后HA组和LA组尼罗罗非鱼血清T-CHO、TG、LDL、LFC含量和MFC含量显著高于CL组；而HA组和LA组罗非鱼血清HDL含量均显著低于CL组，显示肝、血清脂肪含量有上升趋势，可能与多余的氨基酸转化为脂肪有关[13]。

3.3 用不同精氨酸含量饲料投喂对尼罗罗非鱼多胺代谢途径相关基因表达的影响

精氨酸对动物肝脏脂肪积累调节存在两条途径：一氧化氮途径和多胺途径。多胺是生物代谢过程中产生的具有生物活性的低分子脂肪族含氮化合物，主要有腐胺、亚精胺和精胺，其主要功能为促进细胞分裂与分化、增加核酸的稳定性、促进核酸合成、参与蛋白质合成、促进消化道黏膜的修复等[15]。在脂肪调控方面，SSAT控制亚精胺与精胺的比值[16]，对于小鼠前脂肪细胞3T3-L1，SSAT活性与细胞脂肪蓄积量呈负相关关系[17]。经过30 d饲喂试验后，HA组ODC表达量上调，与ODC活性依赖于底物L-精氨酸有关[4]。SSAT表达量上调，可能与ODC表达量上调有关，导致精胺浓度降低[16]，从而激活SSAT活性，促进亚精胺向精胺转化，此过程消耗乙酰辅酶A，乙酰辅酶A是脂肪酸合成的重要原料[16]。其结果是降低脂肪蓄积。

而经过60 d高精氨酸含量饲料饲喂后，由于动物体对精氨酸逐渐适应，摄入多余的精氨酸反而增加底物L-精氨酸含量，从而导致ODC活性下调[18]。从而促使精胺浓度降低，抑制SSAT活性，促使肝脏脂肪积累增加。

CPT-1则是线粒体中氧化长链脂肪酸的限速酶[13]。相对的，ACC和FAS是两个对脂肪酸合成起关键作用的酶。对鱼类脂肪积累起着重要调节作用，随饲料中脂肪含量的降低或升高，其表达量也相应的升高或者降低[7]。本研究设定的精氨酸含量范围以内，各组ACC和FAS的表达量差异不显著。那么，鱼体肝脏、血清的脂肪蓄积，并非脂肪酸合成增加造成的。

3.4 不同精氨酸含量饲料投喂不同时间对尼罗罗非鱼脂肪代谢相关指标的影响

经过30 d不同精氨酸含量饲喂试验后，指示肝脏损伤的ALT、AST含量和LDH含量均显著降低，提示脂肪积累的血清T-CHO、TG含量和LFC均显著低于CL组，而血清HDL含量则显著高于CL组，而且肝ODC、SSAT活性提高，反映短期饲喂高精氨酸含量饲料，可减少肝脂肪积累，对肝脏有一定的保护作用。而试验到60 d后，由于动物体对精氨酸逐渐适应，精氨酸对脂肪蓄积的减少作用降低，反而多余的精氨酸转化为脂肪，导致指示肝脏损伤的ALT含量和AST含量显著提高，而且HA组的LDH含量和ALP含量也显著提高，血清T-CHO、TG、LDL、LFC含量和MFC含量也显著提高，而指示脂肪运输能力的HDL含量则下降，ODC与SSAT表达量也下调，脂肪蓄积增加[19]。

在整个饲喂试验中，ODC与SSAT表达量先上调再下调，导致肝脂肪蓄积及血清生化、脂肪指标随之变化，显示多胺代谢途径在精氨酸调节尼罗罗非鱼肝脏脂肪代谢过程中起重要作用，然而多胺代谢途径影响尼罗罗非鱼血脂、肝脏脂肪蓄积变化的机制仍需进一步研究。

4 结论

①30 d时，高精氨酸含量饲料饲喂可减少尼罗罗非鱼肝脏脂肪蓄积、保护肝脏和减少血清脂肪含量，到60 d时，可增加尼罗罗非鱼肝脏脂肪蓄积、对肝脏造成一定损伤和提高血清脂肪含量，可能与过量精氨酸转化为脂肪有关。

②多胺代谢途径在精氨酸调节尼罗罗非鱼肝脏脂肪代谢过程中起重要作用。