38种中草药对半滑舌鳎源哈维氏弧菌的抑杀效果比较分析

■任 海 华智杰 靳晓敏 高桂生李明媛 王 旭 郑佳瑞

（河北科技师范学院，河北秦皇岛066600）

由于海水鱼类养殖规模、集约化程度提高以及水环境污染等因素的影响，鱼类病害频繁发生，制约了海水鱼类规模化养殖，其中主要以弧菌（Vibrio）引起的疾病最为严重，弧菌是海洋环境中最常见一类条件致病菌。由弧菌引起的疾病在世界各国海水养殖过程均有报道，且给水产养殖业持续发展带来巨大的威胁[1-3]。目前国内外已经报道的弧菌病病原主要有鳗弧菌（V.anguillarum）、哈维氏弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和创伤弧菌（V.vulnificus）等[4]。近年来研究发现，哈维氏弧菌能够引起多种鱼类发病，如在花鲈（Lateolabrax japonicus）[5]、斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）[6]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[7]和半滑舌鳎（C.semilaevis）[8]等均有报道，主要症状表现为游泳缓慢、体表严重溃疡和眼球突出等，该病原菌已成为制约产业发展的重大障碍。目前养殖者主要利用抗生素作为该细菌性疾病的主要防治药物，但是抗生素的频繁使用，不仅使许多病原细菌产生了耐药性，对水产养殖动物产生一定毒害作用，而且抗生素的药物残留最终也会影响人类健康。

中草药是天然药物，具有成本低、不良作用小、无药物残留、不易产生耐药性等优点，备受水产养殖业的广泛关注，现已成为水产动物养殖过程中常见的抑菌药物[9-10]。目前从中草药中筛选抗菌药物越来越受到国内外学者的广泛重视，关于中草药防治细菌性疾病的相关报道亦屡见不鲜，但是关于中草药对半滑舌鳎源哈维氏弧菌研究鲜见报道。因此，本试验通过38种水产常用中草药对哈维氏弧菌的体外抑杀菌情况进行研究，筛选对哈维氏弧菌具有抑杀作用的中草药。本研究结果对防治由哈维氏弧菌引起的水产病害具有一定的参考价值。

1 试验材料

1.1 试验菌株

试验菌株分离于秦皇岛某养殖场患病半滑舌鳎，并经过形态特征、理化特点、16S rDNA鉴定为哈维氏弧菌，同时进行该菌的致病性检测，具体操作为：将健康的半滑舌鳎[体重为（602.6±19.6）g]置于100 L方形玻璃水缸中暂养1周后，随机分为对照组和人工感染组，每组3个重复，每个重复5尾鱼，将28℃培养24 h的待检细菌用生理盐水稀释并计数，使菌液终浓度为2×106CFU/mL，其中人工感染组每尾肌肉注射0.3 mL该菌液，对照组注射等量的灭菌生理盐水，注射12 h后半滑舌鳎出现食欲减退，游泳缓慢等症状，72 h出现严重皮肤溃疡和陆续死亡等现象，与自然发病死亡症状极相似，进一步从病鱼病灶处分离纯化细菌，经过鉴定证实为哈维氏弧菌。

1.2 主要试剂

营养琼脂、营养肉汤、无水乙醇、96孔酶标板，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；鱼腥草、黄芪、甘草、连翘、女贞子、川棘子、诃子、栀子、黄连、黄芩、黄柏、大黄、大青叶、穿心莲、五倍子、柴胡、车前子、乌梅、白头翁、石榴皮、紫锥菊、虎杖、地丁草、秦皮、贯众、苦参、丁香、当归、赤芍、苏木、青蒿、淫羊藿、茵陈、益母草、地锦草、何首乌、地榆、郁金等38种中草药，均购自昌黎县百草堂药店。

1.3 主要仪器设备

恒温振荡培养箱（型号：BSD-100）、电子万用炉（型号：DK-98-II）、电子天平（型号：CP224C）、超净工作台（型号：ZHJH-C1112B）、高压灭菌锅（型号：YXQ-LS-18SI）、电热鼓风干燥箱（型号：GZX-9076MBE）、电热恒温培养箱(型号：HPX-9082MBE)、全温振荡培养箱(型号：BSD-100)。

2 试验方法

2.1 中草药药液的制备

将38种中草药粉碎后，分别称取10 g加入到500 mL烧杯中，用纯化水浸泡3 h后用电子万用炉大火煮至沸腾，小火煎1 h，第一次煎煮药物时需要加入400 mL纯化水，然后再用8层纱布过滤，过滤后的药渣中再加入200 mL的纯化水用小火煮1 h，消毒纱布过滤后，将两次所得药液混合定容至50 mL，制成200 mg/mL(W/V)的中草药原药液[11]，装瓶高压灭菌后置于冰箱4℃冷藏备用。

2.2 打孔培养基的制备

将灭菌营养琼脂放到无菌超净工作台内，当温度降到60～70℃时，在平板内倒入薄薄的一层培养基，待培养基凝固后，在培养基上均匀放置5个牛津杯，然后再次倒入培养基，注意不要倒入牛津杯孔中。第二层培养基的高度约占这个平板高度的2/3，等培养基凝固后拔出牛津杯，放到4℃冰箱保存备用。

2.3 菌种的活化

将保存的哈维氏弧菌菌液融化后接种到普通营养琼脂平板上，将平板置于28℃培养箱中培养24 h，整个过程在无菌超净工作台内进行。

2.4 菌液的制备

在无菌超净工作台上将活化的哈维氏弧菌用灭菌接种环挑取菌落，使哈维氏弧菌与灭菌生理盐水混合均匀后制成的菌悬液，与麦氏比浊管对比后使菌液的终浓度达到108CFU/mL。

2.5 抑菌效果测定

使用牛津杯打孔培养基进行体外抑菌效果测定，每种中草药重复测定3次，取其平均值作为最终抑菌直径。具体为：首先在无菌超净工作台内，用消毒棉签在打孔培养基上均匀涂上菌悬液，然后在每种中草药的药液中分别抽取150μL中草药放到相对应的培养基的孔中，注意不要使药液溢出孔外。待药液加完后置于28℃培养箱内培养24 h后测定抑菌圈直径。敏感性判定标准以抑菌圈直径≥20 mm判定为高度敏感（HS）；抑菌圈直径10～19mm判定为敏感（S）；抑菌圈直径＜10mm的判定为耐药（R）；无抑菌圈形成记作0。

2.6 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定

利用96孔酶标板，采用菌液涂布法和改良微量二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），具体操作方法参考任海等[11]的方法进行。

3 结果与分析

3.1 38种中草药对半滑舌鳎源哈维氏弧菌的抑菌作用（见表1）

表1 38种中草药对哈维氏弧菌的抑菌圈直径

由表1可知：五倍子、诃子、乌梅、黄连、石榴皮、苏木、黄芩、黄柏、连翘9种中草药对哈维氏弧菌表现为高度敏感，其抑菌圈直径为22～27 mm。秦皮、丁香、青蒿、地丁、女贞子、甘草、大黄、虎杖、地榆、苦参10种中草药对哈维氏弧菌较为敏感，其抑菌圈直径为12～19mm。而紫锥菊、地锦草、茵陈、柴胡、车前子、益母草、何首乌、贯众、白头翁、淫羊藿、鱼腥草、大青叶、穿心莲、赤芍、黄芪、川棘子、郁金、当归、栀子对该菌无抑菌作用，部分中草药药敏试验结果如图1所示。

3.2 19种中草药的MIC和MBC

选取具有抑菌效果的19种中草药，测定其对半滑舌鳎源哈维氏弧菌的MIC和MBC。由表2可知，五倍子的抑菌和杀菌效果最强，其MIC、MBC分别为1.5 mg/mL和3.1mg/mL；而乌梅、诃子、黄连、石榴皮、苏木、甘草的抑菌效果较强，其MIC、MBC分别为3.1～12.5mg/mL和6.3～25.0 mg/mL。再有女贞子、地丁、黄柏、秦皮、地榆、青蒿、丁香、苦参、大黄、虎杖、黄芩、连翘也具有抑菌作用，其MIC和MBC分别在12.5～50.0mg/mL和50.0～100.0mg/mL。

图1 部分中草药对哈维氏弧菌的抑菌情况

表2 19种中草药对哈维氏弧菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度（mg/mL）

4 讨论与分析

近年来，随着海水养殖业的不断发展，由弧菌引起的水产动物疾病时有发生，其中针对哈维氏弧菌的报道也越来越多。研究发现哈维氏弧菌能够感染多种海水养殖动物发病，如鱼、虾、蟹和贝类等，严重阻碍了我国海水养殖业的可持续发展[12-18]。目前防治水产细菌性疾病主要依靠各种抗生素，其结果不仅污染了水体养殖环境，而且也导致了一些药残事件的发生，比如“孔雀石绿事件”和“多宝鱼事件”等对人类健康构成了极大的威胁。由于中草药在水产动物疾病预防和治疗过程中无药物残留，不易使病原菌产生耐药性等优点，近年来被广泛用于水产动物细菌性疾病的防治中。王洪彬等[19]在中草药对哈维氏弧菌体外抑菌试验的研究中发现，乌梅、苏木、黄芩、夏枯草、连翘、女贞子的抑菌效果较好。王玉娥等[20]测定了10种常用中草药对5种海洋致病弧菌的抑菌情况，结果发现五倍子抑菌效果最强，其次为黄连，这两种中草药可作为防治水产动物弧菌病的首选药物，本次试验结果与上述研究者的结果相似。本试验通过牛津杯打孔法测定了38种水产常用中草药对哈维氏弧菌敏感性，试验结果表明，五倍子、苏木、乌梅和黄连等9种中草药对哈维氏弧菌表现为高度敏感，其抑菌圈直径为22～27 mm，秦皮、丁香、女贞子和大黄等10种中草药对哈维氏弧菌也较为敏感，其抑菌圈直径为12～19 mm，其中抑菌效果最强的为五倍子，其抑菌直径达27 mm。这与张晓君等[21]研究的20种中草药对分离于长鳍真鲨的病原菌（哈维氏弧菌）进行了药物敏感性检验结果中地锦草能够有效抑制哈维氏弧菌的结果不一致，分析其原因可能是由于中草药和供试菌株的来源不同最终导致药物对其敏感性有差异[22]。

另外，试验利用微量二倍稀释法以及液体涂布法测定了具有较好抑菌作用的19种中草药对半滑舌鳎源哈维氏弧菌的MIC和MBC，试验结果显示：五倍子、乌梅、诃子等9种中草药的抑菌效果较强，其MIC和MBC分别为1.5～25.0 mg/mL和3.1～50.0 mg/mL。该结果与张永刚等[23]报道的中草药对大菱鲆源哈维氏弧菌的体外抑菌效果中五倍子、石榴皮和乌梅等具有很强的抑菌作用结果相似；本试验还发现所选中草药中抑菌作用最强的是五倍子，其MIC和MBC分别为1.5 mg/mL和3.1 mg/mL。该研究结果与王玉娥等[20]研究的5种海洋致病弧菌对34种中草药敏感性的测定中五倍子的MIC和MBC均为3.125 mg/mL的结果较一致，但与张晓君等报道的五倍子对哈维氏弧菌的MIC小于0.195 mg/mL不同[21]，其原因可能与供试菌株的分离源、菌株的毒力大小、中草药的采集地区、药用部位以及炮制方法等有关[11]，但是中草药抑菌的具体作用机理还有待进一步研究。

5 结论

本研究测定了38种中草药对哈维氏弧菌的体外抑菌情况。试验表明，诃子、五倍子、石榴皮、黄连、苏木和连翘等对哈维氏弧菌高度敏感，上述中草药的MIC和MBC范围为1.5～25.0 mg/mL和3.1～50.0 mg/mL，其中抑菌效果最强的是五倍子，其MIC为1.5 mg/mL，MBC为3.1mg/mL。