枫槭叶酶解液美拉德反应及其挥发性成分分析

王宣静,张天兵,苏海洋,梁佳欣,陈治岍,周鹏飞,许春平,*

(1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州 450000; 2.江苏中烟工业有限责任公司技术中心,江苏南京 210019)

香精香料作为一种添加剂已经被广泛应用到食品生产中,它可以弥补食品本身的缺陷,增加食品的香味,掩盖食物的不良气息。近年来,以天然植物的提取物为原料,利用微生物发酵技术[1]、生物酶解技术[2-3]、美拉德反应[4-5]等制备食用香精的研究被广泛报道。徐达等[6]以白玄参为原料,采用复合酶对白玄参进行酶解提取,将酶解液进行浓缩后加入氨基酸进行美拉德反应制备烟用香料,并进行工艺优化,评吸结果表明,该美拉德反应产物可以有效掩盖杂气,减轻刺激性,中和苦味,增加津甜的口感。白家峰等[7]以烟草花蕾酶解液为原料,通过进行不同时间的美拉德反应得到各美拉德反应产物,并利用主成分分析和感官评吸的方法对不同美拉德反应时间的产物的挥发性香味成分进行探究,找到最佳的美拉德反应时间,为烟草花蕾制备烟用香料提供了新方法。郑家伦等[8]以大豆粕为原料,通过酶解进而利用美拉德反应制备咸味香精,研究了酶的添加顺序对酶解液性质的影响,通过测定大豆粕酶解液的水解度、还原糖含量、氨基氮含量等指标,确定酶的添加顺序,提高了产物的感官质量。

枫槭浸膏是枫槭叶粉末经乙醇提取浓缩后得到的产物,多为深褐色膏体,具有焦香、甜香特征,在食品与卷烟工业中多有应用。苏东赢[9]对枫槭浸膏不同温度下的热解产物进行了定性定量分析,并将其加入卷烟中发现突出了卷烟的焦甜香韵,改善了卷烟的抽吸品质。菜莉莉等[10]对市售的5种枫槭浸膏的挥发性成分进行HS-SPME-GC/MS分析,并采用单因素方差分析和主成分分析比较了其挥发性成分的差异。但现阶段对以天然植物枫槭为原料结合美拉德反应制备食品香精的研究还很少。本文对枫槭叶粉末酶解后的酶解液进行不同温度梯度(90、100、110 ℃)的美拉德反应,选用GC-MS联用技术结合主成分分析对枫槭叶粉末酶解液的美拉德反应样品的挥发性成分进行研究,以期充分发挥天然植物枫槭的可用性价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枫槭 广东梅州2017年产;纤维素酶(50000 U/g)、果胶酶(100000 U/g)、半纤维素酶(200000 U/g) 江苏锐阳生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(6000 U/mg) 北京索莱宝科技有限公司;1,2-丙二醇、1 moL/L H2SO4、二氯甲烷、无水乙醇(AR) 天津市富宇化工有限公司;0. 8211 mg/mL乙酸苯乙酯(色谱纯) 美国Sigma-Aldrich公司。

Q-100A3高速多功能粉碎机 上海冰都电器有限公司;DGX-9143电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司;TGL-16 M离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;同时蒸馏萃取装置 郑州科技玻璃仪器厂;Agilent GC6890-MS5973N 型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司;QYC-200摇床 上海福玛实验设备有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵 河南省予华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 预处理 将干燥的枫槭叶粉碎过300目筛,置5～10 ℃的冰箱中备用。

1.2.2 样品酶解处理 根据相关酶解研究[11-13],将预处理后的枫槭叶粉末以料液比1∶10加150 mL水制成水提取物,取部分水提取物在预实验确定的最优酶条件下:酶解温度50 ℃,酶解体系pH为7,酶解加酶量为枫槭的质量的1.5%(四种酶分别为纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶,加酶比例分别为1∶1∶1∶1),酶解5 h。

1.2.3 美拉德反应 以枫槭叶粉末酶解水提取物为原料进行美拉德反应，在150 mL酶解水提取物的样品中加入浓度为30%的氢氧化钠调节pH为7。将枫槭叶粉末酶解液于90、100、110 ℃的油浴锅中进行美拉德反应3 h,其反应产物分别记为A1、S1、B1;将枫槭叶粉末水提取物放置于100 ℃的油浴锅中进行美拉德反应3 h,其反应产物记为S2。

1.2.4 蒸馏萃取提取香味物质 在同时蒸馏萃取装置的平底烧瓶中加入各个美拉德反应样品150 mL,再加入100 mL蒸馏水,摇匀,调节电子调温电热套温度,使得平底烧瓶中物质处于微沸状态,在装置的另一端蒸馏瓶中加50 mL二氯甲烷,在60 ℃水浴锅中加热。观察加热过程,当二氯甲烷与水出现分层时开始计时2.5 h后萃取结束,待冷却后,在二氯甲烷萃取液中加入10 g无水硫酸钠和1 mL浓度为0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(内标物),静置过夜。然后在35～40 ℃的水浴锅中进行浓缩。浓缩样品至约1 mL转至1.5 mL样品瓶中,在2～4 ℃下密封保存,待用于GC/MS进行定量分析[14-17]。利用Nist 11谱库将质谱图中各色谱峰进行检索,同时进行人工解析,对化学成分进行定性分析(匹配度>80%)。采用内标法对物质进行定量。挥发性物质含量(μg/g)=[内标物质量(μg)×挥发性物质峰面积]/[内标物峰面积×样品质量(g)][18]

1.2.5 GC-MS条件 色谱条件:色谱柱为HP-5MS色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm);载气:氦气;载气流量为:3 mL/min;进样口温度:280 ℃;分流比10∶1;进样量 1 μL;升温程序为:初起始温度50 ℃,以4 ℃/min升至280 ℃;质谱条件:EI源;接口温度270 ℃,电子能量:70 eV,四极杆温度:150 ℃;采集模式:扫描;质量扫描范围:35～550 amu。

1.2.6 主成分分析方法 使用SPSS软件进行主成分分析(PCA),计算相关系数矩阵,主成分特征值和累积贡献率。根据进行了不同时间的美拉德反应的枫槭酶解液中相关成分的含量标准化值与特征根、特征向量,计算出各主成分值,并以此作出散点图。

2 结果与分析

2.1 二种不同处理方式的样品香味成分的GC/MS结果分析

根据S1与S2的GC/MS分析结果作图1和图2,观察图1可知,S1与S2相比,挥发性成分醇类、烯类、酮类、酯类、醛类、酚类、杂环类的种类数都有所增加;观察图2可知S1的挥发性成分总量为178.70 μg/g,S2的挥发性成分总量为87.40 μg/g,S1与S2相比,美拉德反应后样品的挥发性成分含量增加了91.30 μg/g。由此得出,枫槭叶酶解后进行美拉德反应,产物中包含了更多的挥发性成分,使产物风味更为独特。

图1 S1和S2枫槭样品挥发性成分种类数Fig.1 Species of volatile components of maple samples S1 and S2

图2 S1和S2枫槭样品的挥发性成分含量Fig.2 Histogram of volatile components of maple samples S1 and S2

2.2 不同温度的美拉德反应样品GC-MS数据的分析

枫槭叶酶解液90 ℃条件下的美拉德反应样品A1、100 ℃条件下美拉德反应物样品S1、110 ℃条件下美拉德反应物样品B1的挥发性成分经GC-MS检测结果见表1。

表1 枫槭叶酶解液不同温度的美拉德反应样品挥发性物质含量(μg/g)Table 1 Content of volatile matter in Maillard reaction samples of maple leaf enzymatic hydrolysate at different temperatures(μg/g)

对枫槭叶粉末酶解液在不同温度下美拉德反应样品的挥发性成分进行GC-MS分析。从GC-MS的分析结果(表1)可以看出,已鉴定出挥发性成分主要包括酸类、醇类、萜烯类、酮类、酯类、酚类、醛类、杂环类和其他类。A1、S1、B1中已鉴定出的挥发性物质种类分别有67种、55种、50种,其中反应温度为90 ℃(A1)中挥发性成分种类最多;挥发性成分总量从多到少所对应的样品依次为A1、S1、B1,挥发性成分总量分别为235.9、178.7、174.7 μg/g,其中反应温度为90 ℃(A1),鉴定出的挥发性成分含量最多。

续表

续表

枫槭叶粉末酶解液进行美拉德反应后,样品的挥发性成分中酸类化合物在A1中含量最高,为47.6 μg/g,其中肉豆蔻酸含量最高,为17.4 μg/g,肉豆蔻酸是具有花香、甜香等香味特征的化合物[19];醇类化合物的含量在A1、S1、B1中相差不大;萜烯类化合物、酮类化合物在A1中含量最高,其中1-石竹烯在S1萜烯类化合物中含量最高,为16.7 μg/g,4-甲基-1-(1-甲基乙基)-双环[3.1.0]己-3-烯-2-酮在A1酮类化合物中含量最高,为12.1 μg/g,这些物质本身都带有独特的香味,对整体风味起到一定修饰作用;酯类化合物含量S1略高于A1,其中二氢猕猴桃内酯在A1酯类化合物中含量最高,为8.1 μg/g,二氢猕猴桃内酯具有典型的木香、茶香和桃子香气的特征[20],对香气有较好的影响。

2.3 枫槭酶解液不同温度美拉德反应特征致香成分分析

美拉德反应又称为羰氨反应,是羰基化合物(还原糖类)和氨基化合物(氨基酸)间的反应,其产物能赋予食品愉快的香味。表1杂环类中1-丁基-1H-吡咯、2-戊基呋喃、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪为美拉德反应的特征致香成分[21]。

美拉德反应特征致香成分总量在A1中含量最高为25.0 μg/g,其中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高为23.5 μg/g,吡嗪类物质的形成是氨基亲核进攻羰基并发生加成和脱水反应的结果[22],一般具有坚果、烧烤等风味特征[23],能够增加食品的甜香和焦香香韵;2-戊基呋喃、1-丁基-1H-吡咯在A1中含均为0.6 μg/g,2-戊基呋喃是具有豆香、果香、清香的化合物[24-25],1-丁基-1H-吡咯是具有烘烤香韵的化合物,这些化合物整体阈值较低,对枫槭美拉德特征香味的形成有着重要的影响。A1中杂环类占比(10.60%)相对于酸类(20.18%)、醇类(22.26%)、烯类(20.26%)、酮类(15.35%)较低,可能是因为所设置的美拉德反应的时间较短,还未形成足够的特征性风味物质。

2.4 主成分分析

利用IBM SPSS Statistics 21软件因子分析模块中的降维分析[26],用主成分分析分析不同温度美拉德反应后的枫槭酶解液中86种挥发性成分,得到主成分载荷矩阵表(见表2)、特征值和贡献率(见表3)。

表2 主成分载荷矩阵Table 2 Principal component load matrix

表3 2种主成分的特征值和贡献率Table 3 Characteristic values and contribution rates of 2 main components

由主成分载荷矩阵表(表2)可以得出,在主成分1中,载荷值较高的正影响挥发性成分有3,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛、金合欢基丙酮、萜品烯、棕榈酸、丁香酚,载荷值依次是0.999、0.996、0.996、0.987、0.983,主要指向醛、酮类物质;负影响最大的为反油酸,载荷值为-0.999。在主成分2中,载荷值较高的正影响挥发性成分有左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮等物质载荷较高,载荷值依次是0.997、0.996、0.986、0.980、0.962,主要指向烯、醇类物质;负影响最大的为3-甲基-6-(1-甲基亚乙基)-环己烯,载荷值为-0.994。主成分载荷矩阵显示了各变量与各主成分之间的关系,数值的绝对值越大,表明该指标与某一主成分的联系紧密程度越大,反映了该指标在该主成分上的载荷程度;载荷值小的挥发性成分对枫槭的挥发性风味贡献小,同时也表明它的含量极低或未检出。

由表3可知,主成分1、2的累积贡献率达到100%,则说明这86种挥发性成分可以分别用主成分1、主成分2进行主成分分析。综合表2可认为3,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛、金合欢基丙酮、萜品烯、棕榈酸、丁香酚、左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮为枫槭挥发性成分的主要特征化合物。

根据表1中三个进行不同美拉德温度处理的样品中86种香气成分的相对含量、表3中2种主成分的特征值和表2中86种香气成分的载荷值计算出三个样品中的第一、第二主成分值,然后以第一主成分为X标,第二主成分为Y坐标,做主成分分散图(图3)、散点图(图4)。图4中的86种香气成分对应于表1中的香气成分。

图3 美拉德处理温度不同的三个样品的主成分分散图Fig.3 Principal component dispersion diagram of three samples with different Maillard treatment temperature注:1为美拉德反应90 ℃的样品,2为美拉德反应 100 ℃的样品,3为美拉德反应110 ℃的样品。

图4 不同美拉德处理温度的86种香气成分散点图Fig.4 Scatter diagram of 86 aroma components with different Maillard treatment temperature

由图3可知,3个样品根据距离远近可分为3个区域,美拉德反应90、100、110 ℃的样品彼此距离较远,表明3个样品的主成分差异均较大。通过观察图4可知,美拉德反应90 ℃的香气主成分集中在第二象限,对其特征香气影响较大的香味物质主要包括正十五酸、十四烷酸、叶绿醇等;美拉德反应100 ℃的香气成分主成分集中第一象限,对其特征香气影响较大的香味物质主要包括(+)-香橙烯、亚油酸乙酯、4,6,6-三甲基二环[3.1.1]庚-3-烯-2-酮等香味物质;美拉德反应110 ℃的香气成分主成分集中在第四象限,对其特征香气影响较大的香味物质主要包括棕榈酸甲酯、左旋-alpha-蒎烯、环乙烯甲醛等香味物质。

GC-MS数据结果表明,90 ℃时挥发性物质的含量和种类最多,主成分分析同样发现90 ℃美拉德反应样品挥发性物质分布最多,多为酸类、醇类、酮类物质,酸类物质本身带有独特的香气;饱和醇风味阈值较高,香味不明显,不饱和醇阈值较低,具有蘑菇香气;酮类物质具有一定的果香味,有研究表明一些酮类物质在低阈值时与醛类或其他物质存在相互作用,产生气味增强或改变现象[27]。结合上述结果可认为美拉德反应温度为90 ℃时得到的样品具有最佳的风味和感官品质。

3 结论

本文分别以枫槭叶水提取物、枫槭叶酶解液为原料进行美拉德反应,与枫槭叶水提取物的美拉德反应样品相比,枫槭酶解液美拉德反应样品的挥发性成分种类和含量都有所增加。枫槭叶酶解液经不同温度的美拉德反应后香味成分的种类和含量变化较大,美拉德反应90 ℃的样品挥发性香味成分的种类最多为67种,主要包括酸类、醇类、萜烯类、酮类、酯类、酚类、醛类、杂环类和其他类。其中美拉德反应90 ℃时样品挥发性物质总量含量最高,达235.9 μg/g。通过主成分分析可知美拉德反应90、100、110 ℃的样品彼此距离较远,表明其主成分差异均较大,90 ℃美拉德反应挥发性物质分布最多,且认为3,4-二甲基-3-环己烯-1-甲醛、金合欢基丙酮、萜品烯、棕榈酸、丁香酚、左旋-beta-蒎烯、桃金娘烯醇、十二烷酸、2,2′-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)、甲基庚烯酮为枫槭挥发性成分的主要特征化合物。结合上述结果可认为在美拉德反应温度为90 ℃时得到的样品具有最佳的风味和感官品质。