DAX-1真核表达载体的构建及其活性的检测

杨丽华 王芳 余柯达 邹立波

剂量敏感的性别反转先天性肾上腺发育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal，adrenal hypoplasia critical region，on chromosome X，gene 1，DAX-1），又称NR0B1（nuclear receptor subfamily 0，group B，member 1）是编码核受体超家族1蛋白的成员。人类DAX-1 基因位于X染色体p21，编码一个含470个氨基酸的蛋白质，是一种转录因子，主要在哺乳动物的生殖系统中表达，如睾丸、卵巢、下丘脑、垂体、肾上腺等［1］。已有研究证明肾上腺发育不全、促性腺激素分泌不足的性腺机能减退及男性不育症的发病与DAX-1突变有关［2-3］。本研究拟构建人DAX-1 的真核表达载体，并利用双荧光素酶报告系统检测其转录活性，为后续研究DAX-1突变致病及DAX-1表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肾上腺皮质瘤细胞（Y-1）购自中科院上海细胞库，人睾丸组织的RNA、高保真DNA聚合酶购自Takara公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、柱回收试剂盒购自Omega公司，引物合成及DNA测序于上海英潍捷基贸易有限公司完成，脂质体 LipofectamineTM2000、载体购自Invitrogen 公司，双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司，DMEM 培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco 公司，培养皿、培养板、移液管等耗材均购于Corning公司。

1.2 方法 （1）人DAX-1基因cDNA编码区全长序列的获取根据Gene bank中DAX-1的序列用 Prime premier 5.0 软件设计引物。DAX-1引物序列：上 游5'CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3'下 游5'CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3'分别在上游和下游引物的5'端加上Hind Ⅲ和BamH1酶切位点。将人睾丸组织RNA逆转录合成cDNA，方法参照Fermentas反转录试剂盒说明书。以cDNA为模板进行PCR反应，反应体系：cDNA（0.1 µg/µl）：1 µl；5×Prime STAR GXL Buffer：10 µl；dNTP Mixture（2.5 mM each）：4 µl；primer F（10 pM）：1 µl；primer R（10 pM）：1 µl；Prime STAR GXL DNA Polymerase：2 µl；H2O：31 µl；总体积50 µl。PCR循环条件：①98℃ 2 min；②98 ℃10 s；③60 ℃15 s；④68℃1 min 45 s；⑤重复②~④步骤，进行30个循环；⑥68 ℃ 5 min；⑦4℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物大小。（2）重组质粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1的构建：用胶回收试剂盒回收扩增的PCR产物，用Hind Ⅲ-HF和BamH1-HF分别双酶切PCR产物和带HA多肽标签的pcDNA3.1（+）' 37℃ 4 h。反应体系分别为：①PCR产物30 µl；NE Buffer 4 5 µl；Hind III-HF 1 µl；BamH1-HF 1 µl；ddH20 13 µl；总体积 50 µl；②pcDNA3.1（+）-3' HA 10 µl；NE Buffer 4 5 µl；Hind III-HF 1 µl；BamH1-HF 1 µl；ddH20 33 µl；总体积50 µl。对酶切后的产物分别进行柱回收和胶回收，T4 DNA连接酶连接回收后产物，连接体系：pcDNA3.1（+）-3'HA：2 µl；回收的DNA片段6 µl；T4 Ligase 1 µl；10×Ligation Buffer：1 µl，16 ℃ 8 h，取连接产物5 µl加入到50 µl DH5a感受态细胞中，置于冰上30 min，42 ℃热击45 s，冰上放置2 min，加入600 µl不含抗生素的LB培养液，37 ℃摇床培养60 min，取200 µl涂板（含100 µg/ml氨苄青霉素的培养板），放37 ℃培养过夜。挑克隆进行菌液PCR验证，取阳性克隆送测序。③瞬时转染Y-1细胞：用含有10%胎牛血清DMEM完全培养基培养Y-1细胞，放置于37℃、5%CO2培养箱中，按照无菌操作台内的常规细胞培养方法培养。将处于对数生长期的Y-1细胞以1.5×105/孔密度接种于24孔培养板，待第2天细胞贴壁后，根据转染试剂LipofectamineTM 2000的转染步骤，将重组质粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1与StAR（实验组，各100 ng）和pcDNA3.1（+）-3'HA空载与StAR（对照组，各100 ng）分别共转染到Y-1细胞中。实验组与对照组均转染TK（10 ng）作为内参。转染24 h后收集细胞，检测荧光素酶活性。上述实验每组设3个平行孔，每组实验重复3次。④荧光素酶活性测定：按照Promega公司双荧光素酶检测试剂盒提供的操作方法检测在Y-1细胞中DAX1对StAR启动子荧光素酶活性的改变。用1×PBS溶液将细胞洗涤2次，向每孔中加入100 µl 1×Passive Lysis Buffer，在室温下轻晃15 min裂解细胞。分别取裂解液5 µl，加底物荧光素（LARII）19 µl在Modulus TM多功能光度计上测定萤火虫荧光素酶活性，后加入终止液（STOP）19 µl检测海肾荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶活性/海肾素荧光素酶活性的值作为荧光素酶活性。以转染pcDNA3.1（+）-3'HA空载和StAR的Y-1细胞作为对照，实验组的荧光素酶活性为其相对值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，用t检验。以P<0.05为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 PCR法获得DAX-1基因 利用PCR法，成功获取约1413 bp的目的片段，见图1。

图1 DAX-1基因的PCR扩增结果

图2 重组质粒pcDNA3.1（+）-3'HADAX1双酶切结果

2.2 重组载体的鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳酶切结果显示，近1413bp处的条带为酶切后的目的片段，测序结果也显示该片段为DAX1编码基因，表明pcDNA3.1（+）-3'HADAX1构建成功。实验重复3次，结果均一致。见图2。

2.3 荧光素酶活性的检测 实验组荧光比值 为（0.065±0.002）；对照组荧光比值为（0.198±0.128）， 两组差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

图3 双荧光素酶报告系统测定DAX-1活性结果

3 讨论

目前全球约有15%的育龄夫妇面临不能生育的困扰，其中50%是由于男性不育。近年来，其发病率逐年增加且逐渐倾向年轻化［4］。男性不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道、小鼠模型及二代测序等的研究成果中可以推断遗传因素起较大作用［5］。越来越多的研究证实基因突变与男性不育的相关性［6］。这些基因的突变可使青春期发育受损，随后由于下丘脑-垂体对性腺或其基因有重要促进作用的因子缺乏，最终引起男性不育。DAX-1即是属于下丘脑-垂体-性腺轴上的基因，其编码蛋白是核受体家族的成员。DAX-1蛋白作为一种转录因子对垂体促性腺细胞和肾上腺皮质的发育起非常重要的作用，已有研究证明肾上腺发育不全及促性腺激素分泌不足的性腺机能减退的发病与DAX-1突变有关［2］。DAX-1敲除的雄性小鼠性腺机能减退、精子发生异常、生精上皮细胞退化［7］。DAX-1在大鼠Sertoli细胞中的表达受FSH激素水平的调节，进一步证明在出生后水平DAX-1可能对精子发生产生影响，且睾丸中DAX-1在精子发生中的作用与观察到的某些生精障碍的肾上腺发育不全及促性腺激素分泌不足的性腺机能减退患者相一致［8］。2014年，作者对766例男性原发性无精子症患者DAX-1基因外显子进行测序，同样也证实DAX-1基因的变异与原发性无精症的发生存在相关性，表明DAX-1可能是临床男性不育一个潜在的诊疗靶点［3］。StAR基因编码类固醇激素灵敏调节蛋白，主要在肾上腺、睾丸、卵巢等与类固醇激素生成有关的细胞和组织中表达。该基因的表达受许多调节因子的正负调控，这些调节因子可与StAR启动子上的调控元件相互作用。研究表明，DAX-1蛋白与StAR基因启动子区域的发夹结构相互作用，抑制其转录，调控肾上腺及性腺的发育［9］，DAX-1某些点突变可使该抑制作用丧失，可能对精子发生产生影响，从而导致男性不育的发生［10］。

报告基因技术近年来普遍用于分析启动子活性，其灵敏度较高、检测方便且具有内参照，可提高实验的准确度。双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶，经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少外部干扰，使实验数据更可信。本实验成功构建人DAX-1真核表达载体并采用双荧光素酶报告系统检测其具有转录活性，可与StAR启动子上的调控元件相互作用，明显下调StAR基因的表达，为进一步研究DAX-1功能及调控机制奠定实验基础。