RSV感染性毛细支气管炎与基质金属蛋白酶-3基因多态性的相关性分析

杨依真 朱亚非* 王俊辉

急性毛细支气管炎（CB）是一种常见于<2岁婴幼儿的急性下呼吸道感染性疾病，最常见的病原体是呼吸道合胞病毒（RSV）［1］。约70%的儿童在生后第1年感染RSV，至2岁>90%儿童均感染过RSV。美国感染RSV的婴幼儿病死率为0.0022%~0.0024%［2］，西班牙0.11%~0.18%［3］，在中低收入国家中则更高。早期评估患儿是否存在发生重症RSV感染性毛细支气管炎的高危因素十分重要。基质金属蛋白酶（MMPs）是一组能特异性降解细胞外基质成分的Zn2+依赖性蛋白水解酶家族，包括MMP1-20。MMPs与RSV感染性毛细支气管炎的发生、发展及疾病的严重程度、疾病后期的气道高反应等均有密切关系［4-7］。本文探讨MMP-3基因上rs522616和rs679620位点的基因多态性与RSV感染性毛细支气管炎易感性和严重性的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017年1月至2018年12月本院诊断毛细支气管炎（参考《实用儿科学》第8版［8］）的2~24个月杭州汉族儿童145例（病例组），经鼻拭子呼吸道合胞病毒抗原检测（胶体金法）诊断为RSV感染，根据Bearman和Pierson 修订的临床评分标准评分［9］分为轻、中度组（122例）和重度组（23例），由专人记录患儿的病史资料，除去双胎儿、早产儿、先心病、支气管肺发育不良等基础性疾病患儿。同时配对杭州汉族健康儿童124例为对照组，且均无毛细支气管炎病史。另根据是否为特异性体质（既往有反复喘息史，或有严重湿疹史，或有药物、食物过敏史，或过敏原检测阳性），将所有研究对象分为特异性组（54例）和非特异性组（215例）。病例组和对照组性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05）。在检查前家属均签署知情同意书，由医院伦理委员会批准。

1.2 方法 （1）标本采集：采集患儿外周血1 ml，离心

后取血清在-80 ℃冰箱冷冻保存，后统一送至杭州祥音生物医药科技有限公司进行基因位点测序分析。（2）引物设计：rs522616引物序列：F-GGGAGGAGGGGAAAAGGTTG，R-GGAGGAAAACCTCATGGGCA。rs679620引物序列：F-AGGCAATGAGTAACAAGTGGA，R-CCTGTA-GGAGAAAAATTGAAGCAGA。（3）基因测序实验流程：从标本中提取DNA后进行PCR扩增、产物电泳及纯化。将纯化后的产物，使用ABI.3730XL测序仪进行测序。最后使用Softgenetics公司的Mutation Surveyor软件进行峰图比对。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。计数资料以n（%）表示，采用卡方检验。评价样本的遗传平衡状态及代表性用Hardy-Weinberg平衡检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs522616和rs769620基因型分布平衡检验 见表1。

表1 rs522616和rs769620基因型分布Hardy-Weinberg平衡检验（n）

2.2 病例组和对照组rs679620的基因型及等位基因分布 病例组和对照组rs679620位点的基因型及等位基因分布差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 rs679620基因型及等位基因分布与病情严重程度相关性 重度组AG基因型频率明显高于轻、中度组（P<0.05）。见表3。rs679620的基因型及等位基因分布与特异性体质无相关（P>0.05）。

表3 rs679620轻、中组和重组的基因型及等位基因分布［n（%）］

2.4 rs522616的多态性可能与特异性体质的相关性 基因型AA在特异性组出现频率高于非特异性组（χ2=8.679，P<0.05）。见表4。rs522616的多态性与疾病易感性无相关（χ2=0.914、0.262，P>0.05）；且与病情严重程度也无相关（χ2=0.895、0.542，P>0.05）。

表4 rs522616在特异性组和非特异性组的基因型及等位基因分布［n（%）］

3 讨论

RSV感染呈自限性，但重症RSV性毛细支气管炎可至呼吸衰竭而死亡［10］。导致RSV感染疾病严重度不同的原因尚不明确［11］。感染后宿主的遗传背景可能是重要因素之一。

MMPs是一组Zn2+依赖性蛋白水解酶家族，对细胞外基质（ECM）有非常广泛的降解功能和调节其动态平衡的能力［12］。MMP-3被认为是MMPs 家族中的一个关键酶，位于人基因染色体11q22. 3区域，能降解多种细胞分子和细胞外基质蛋白。MMP-3基因的多态性，目前主要有启动子区域-1171（5A/6A）位点、5'端转录调控区rs522616位点、2号外显子rs679620位点等位点的相关研究。基因的多态性是导致疾病在不同人群中的易感性及严重性存在差异的重要原因［13］。

SATASHI等［14］研究发现RSV感染会促进MMP-3的表达。NERUSU等［15］研究认为MMP-3有促进肺损伤的作用，推测MMP-3可能是通过直接损伤血管壁或组织间隙中连接组织的成分促进炎症细胞的渗出，加重炎症反应，从而加重肺损伤。ANNEMIEKE等［16］研究显示，在中、重组RSV毛细支气管炎患儿中MMP-3及TIMP-1的水平明显升高，而MMP-3在重度组患儿体内升高更为明显。通过研究MMP-3的基因多态性，发现在MMP-3基因启动子区域的rs522616位点的A等位基因可能与RSV感染的严重程度有关。推测该等位基因可促使MMP-3的表达水平过度升高，从而加重肺组织损伤，这可能是造成重症RSV感染的重要原因之一。

本研究显示，rs679620的A等位基因在病例组出现频率高于对照组，病例组的等位基因A分布也高于对照组。AG基因型在重度组出现的频率高于轻、中度组，提示MMP-3基因上rs679620位点的等位基因A可能与RSV感染性毛细支气管炎的易感性有关，基因型AG可能与疾病的严重程度有关。但rs679620的基因型及等位基因在特异性组和非特异性组分布差异无统计学意义。此外MMP-3 SNPrs522616基因型、等位基因频率与RSV感染性毛细支气管炎的易感性均无明显相关，且在轻、中度组与重度组间差异无统计学意义。但rs522616的AA基因型在特异性体质组出现频率明显高于非特异性体质组，提示rs522616的AA基因型可能与人群中的特异性体质有关。本研究结果与ANNEMIEKE等报道不一致，可能与人种差异、抽样误差、样本数小、生长环境等有关。因此，对于MMP-3基因多态性与RSV感染性毛细支气管炎发生、发展的关系，还需从不同角度进行深入的研究。

本研究结果显示，rs522616的AA基因型在特异性体质组出现频率明显高于非特异性体质组，提示MMP-3基因rs522616位点的AA基因型可能与特异性体质有关。特异性体质也是易诱发哮喘的因素之一，有学者认为RSV感染后引起毛细支气管炎可能是特异性体质的早期标志［17］。也有研究认为RSV感染后是否出现喘息与特异性体质无明显关系［18］。目前倾向RSV感染与特异性体质及其他一些先天因素可相互作用，共同促进哮喘的发生。一方面若患儿本身存在特异性体质、肺解剖及生理异常等先天因素，在RSV感染后则更易出现喘息及发展为哮喘；另一方面RSV感染后破坏气道黏膜上皮，可降低机体对变应原的防御力，还能诱导机体免疫状态发生改变。