SATB1介导上调Snail/Slug信号通路促进直肠癌上皮间充质转化影响肿瘤预后分析

李彦 潘烽平 彭勃 李海强 张明明 周莉

随着现代外科全直肠系膜切除术（TME）理论的广泛认可和应用以及术前新辅助放、化疗的开展，直肠癌患者在保证肿瘤根治前提下的极限保肛手术屡见不鲜，但仍有5%~40%的患者术后发生局部复发或转移［1］。究其原因，考虑与手术残留但又未被常规病理学发现的危险转移灶有关。研究表明，肿瘤在细胞形态发生明显变化之前，其分子水平及生化代谢水平方面已发生异常改变，出现功能异常的癌基因产物或产物表达增强，并由此引出肿瘤微转移与肿瘤分子切缘的概念，并可将肿瘤微转移作为评估肿瘤分子切缘的标准之一。本文回顾性分析80例直肠癌患者的临床资料，通过SATB1介导Snail/Slug信号通路调控上皮间质转化评估肿瘤微转移，分析直肠癌标本切缘及区域淋巴结肿瘤微转移与患者预后相关性，探讨SATB1介导上调Snail/Slug信号通路促进直肠癌上皮间充质转化影响肿瘤预后的指导价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年5月至2016年5月本院80例直肠癌患者的临床资料，纳入标准：（1）中低位直肠癌Dixon术式，除外Mile’s及Hartmann术式，肿瘤均位于腹膜反折处或腹膜反折以下；（2）均为M0，除外有远处转移；（3）直肠癌初次治疗，除外曾行肿瘤局切或曾行术前新辅助放化疗；（4）单纯直肠癌，除外罹患其它恶性肿瘤患者。排除标准：（1）术后需进一步行放疗；（2）术中下切缘快速冰冻病例切片提示阳性而需补切除；（3）术后石蜡病理回报下切缘或环周切缘阳性患者。其中男41例，女39例，平均年龄（63.1±9.3）岁。所有患者手术均由同一组医生完成，手术方式均为DIXON术式，所有标本采集均获得本人同意并签署知情同意书，报医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法 （1）标本取材及资料收集：下切缘组织、正常肠黏膜组织、肿瘤组织标本取材时间均为手术中标本离体后立即进行；环周切缘标本及区域淋巴结标本取材与病理科环周切缘取材同步进行。标本取材后立即放入-80 ℃深低温冰箱保存。患者临床资料包括：一般资料（性别、年龄、BMI值等）、T分期、N分期、TNM分期、肿瘤分化程度、神经侵犯、脉管侵犯、淋巴结转移数量、肿瘤直径（cm）、KRAS及NRAS基因突变情况、微卫星DNA稳定性、术后化疗完成情况及术后随访情况（时间依赖生存状态，包括无瘤生存时间、局部复发时间、远处转移时间三个时间控制点）等指标。（2）RNA提取和实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）：提取总RNA，将2 µl RNA溶液在核酸测定仪检测RNA260/280 OD值，测定RNA浓度，于-80 ℃保存；将1 µl RNA及逆转录试剂盒置入冰上融化，70 ℃水浴中孵育5 min，低速离心后42 ℃60 min，70 ℃10 min上机行逆转录，合成cDNA 第一链，反应产物置于-80 ℃条件下保存备用。SYBR® Green Realtime PCR Master Mix反应体系（引物序列见表1），95 ℃变性60 s，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸15 s，PCR反应共40个循环。PCR扩增反应后绘制溶解曲线，应用MJ Opticon Monitor 3.0分析软件计算得Ct值，然后以GAPDH mRNA作为内参进行标准化，最后计算各标本RNA相对表达量。（3）Western blotting分析：提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，每个样本取40 µg分别加入10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）的样本孔中进行凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移到甲醇浸泡后的PVDF膜，300 mA恒流转膜60 min，丽春红染液染色，5%脱脂牛奶封闭，兔抗人SATB1单克隆抗体（1∶1000）、鼠抗人Snail单克隆抗体（1∶1000）、兔抗人Slug多克隆抗体（1∶2000）、兔抗人E-cadherin多克隆抗体（1∶1500）、兔抗人Vimentin多克隆抗体（1∶500）、鼠抗人GAPDH多克隆抗体（1∶700），一抗4 ℃过夜孵育。洗涤膜3次并在室温下与二抗孵育2 h。使用超敏型ECL化学发光显色试剂进行显色，用UVP凝胶成像仪检测蛋白灰度并拍照成像。

表1 SATB1及Snail/Slug信号通路基因引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Spearman法，患者预后（时间依赖生存状态，包括无瘤生存时间、局部复发时间、远处转移时间三个时间控制点）的相关因素行COX多因素分析，生存率影响采用Kaplan-Meier法，并制作生存曲线，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 局部复发患者与无瘤生存患者SATB1及EMT各标志基因表达比较 80例患者随访时间40~67个月，平均（53.6±12.6）月，无瘤生存67例，局部复发9例，远处转移4例（肝转移1例、肺转移1例，合并肝肺转移2例），无死亡患者。局部复发患者相比无瘤生存患者切缘及区域淋巴结组织中SATB1、Snail及Slug表达明显增加，E-cadherin表达减少，远处转移患者相比无瘤生存患者SATB1表达增加。RT-qPCR结果显示：相比无瘤生存患者（SATB1、E-cadherin、Snail及Slug相对表达量分别为：3.014±0.361、1.081±0.141、2.211±0.343及2.431±0.413），局部复发患者SATB1（5.135±0.713；t=2.776，P=0.0091）、Snail（3.714±0.453；t=2.698，P=0.0094）及Slug（3.981±0.676；t=2.837，P=0.0086）表达均显著增高，E-cadherin表达减少（0.713±0.131；t=2.031，P=0.0371）；远处转移患者SATB1（4.417±0.676；t=2.351，P=0.0215）表达增高，Snail（2.341±0.416）、Slug（2.576±0.348）及E-cadherin（1.098±0.067）表达量差异无统计学意义（P>0.05）。Western blotting分析结果同以上结论。

2.2 SATB1及EMT各标志基因（E-cadherin、Snail及Slug）行RT-qPCR及Western blotting检测结果结合Spearman法检验时间依赖生存状态相关性分析 （1）当预后以无瘤生存为时间控制点时，E-cadherin表达与无瘤生存时间呈正相关（r=0.817，P<0.05），SATB1表达与无瘤生存时间呈负相关（r=-0.571，P<0.05），Snail表达与无瘤生存时间呈负相关（r=-0.667，P<0.05），Slug表达与无瘤生存时间呈负相关（r=-0.883，P<0.05）；（2）当预后以局部复发为时间控制点时，E-cadherin表达与局部复发时间呈负相关（r=-0.341，P<0.05），SATB1表达与局部复发时间呈正相关（r=0.856，P<0.05），Snail表达与局部复发时间呈正相关（r=0.754，P<0.05），Slug表达与局部复发时间呈正相关（r=0.431，P<0.05）；（3）当预后以远处转移为时间控制点时，SATB1表达与远处转移时间呈正相关（r=0.616，P<0.05），见图1。

2.3 COX多因素分析 （1）当预后以无瘤生存为时间控制点时，T分期、TNM分期、肿瘤分化程度、SATB1、Snail及Slug均为影响预后的危险因素，其中SATB1表达增加为独立性危险因素。（2）当预后以局部复发为时间控制点时，T分期、TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤直径（cm）、术后化疗完成情况、SATB1、E-cadherin、Snail及Slug均为影响预后的危险因素，其中SATB1表达增加为独立性危险因素。（3）当预后以远处转移为时间控制点时，T分期、N分期、TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移数量、术后化疗完成情况、SATB1均为影响预后的危险因素，其中SATB1表达增加为独立性危险因素。

图1 SATB1及Snail/Slug信号通路基因表达与时间依赖生存状态相关性分析

3 讨论

传统方法判断直肠癌手术标本切缘主要基于对切缘组织的常规病理学（即细胞形态学）观察，然而在常规病理学诊断为切缘阴性患者中，仍有10%~30%患者出现局部复发或远处转移［2］。究其原因，考虑常规病理学对形态上（或表型上）与正常细胞无可见差异的癌前细胞或具有潜在转化能力的“正常”细胞无区分能力有关，这就引出肿瘤微转移的概念。肿瘤微转移是指用常规影像学、病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤患者体内小簇或单个癌细胞的微小转移灶，是多种恶性肿瘤复发和转移的潜在因素。STAB1是人类组织特异性核基质域DNA结合蛋白，位于人3号染色体短臂2区3带，是人类T细胞的增殖和分化过程中一种必不可缺少的调控蛋白［3］。最近研究发现，SATB1表达上调与多种类型的侵袭性和转移性恶性肿瘤相关，包括胃癌，乳腺癌，膀胱癌，肝癌和前列腺癌等。这些结果均表明，SATB1是一个独立的预后因素，SATB1过表达的患者常预后不佳，是研究肿瘤治疗的靶点［4］。SATB1可通过介导Snail/Slug信号通路参与上皮-间质转化（EMT），在细胞分化胚胎发育过程中扮演重要的调控角色，也是影响肿瘤侵袭和转移重要步骤［5］。E-cadherin是一种上皮细胞特异性标志蛋白，E-cadherin表达下调或缺失标志着肿瘤发生EMT，也是EMT过程发生的基础与核心。

FU等［6］研究表明，恶性肿瘤可以通过构建过表达质粒而使SATB1表达上调，E-cadherin表达下调，并通过构建干扰质粒下调细胞中SATB1表达使E-cadherin表达上调，促进肿瘤向正常形态转变，提示SATB1表达的下调可以逆转 EMT过程。本研究结果也支持这一观点，局部复发的中低位直肠癌患者相比无瘤生存患者切缘及区域淋巴结组织中SATB1、Snail及Slug表达明显增加，而E-cadherin表达减少；远处转移患者相比无瘤生存患者切缘及区域淋巴结组织中SATB1表达增加。LAMBERT等［7］研究发现，肿瘤细胞中，通过构建过表达质粒而上调SATB1表达可促进 E-cadherin抑制因子Snail和Slug表达，继而抑制E-cadherin表达，最终诱发肿瘤细胞EMT发生。而TARHAN等［8］研究发现SATB1可促进肿瘤细胞迁移、侵袭及凋亡，并影响患者预后，与患者预后不良存在明显相关性，促进肿瘤侵袭和进展。在本研究中，肿瘤切缘组织中E-cadherin表达与患者无瘤生存时间呈正相关，与局部复发呈负相关；而SATB1、Snail及Slug表达与患者无瘤生存时间呈负相关，与局部复发呈正相关；SATB1表达与患者远处转移呈正相关。表明SATB1表达增加可通过介导Snail/Slug信号通路调控直肠癌切缘腺上皮组织间质转化，增强肿瘤的侵袭、转移能力，与直肠癌浸润和转移潜能显著相关。

研究表明上皮-间质转化（EMT）在细胞分化过程中起重要调控作用，也是肿瘤侵袭和转移最重要的一步。EMT发生后，上皮细胞失去细胞极性，细胞间基质紧密链接减少，细胞进而获得间质特性，导致细胞通路基因表达发生改变，继而细胞形态、生物学行为发生改变，使细胞运动迁移和侵袭能力明显增强，此种侵袭性表型细胞产生特异性降解蛋白酶进而降解基底膜而有利于肿瘤细胞迁移和转移［9］。本研究中结果也支持点，COX多因素风险比例模型检验提示，E-cadherin表达减少、Snail及Slug表达增加主要是影响患者无瘤生存为时间及肿瘤局部复发的危险因素，但无论预后为何种时间依赖生存状态，SATB1表达增加为独立性危险因素。表明EMT可有效评估肿瘤微转移，是肿瘤原位侵袭和远处迁徙、进展的基础。本研究仅在分子水平的基因和蛋白层面证实了直肠癌微转移与SATB1及EMT标志基因的表达密切相关，至于SATB1是通过何种途径诱导EMT过程，是直接调控EMT标志基因（如E-cadherin、Snail及Slug等），还是通过其他信号传导通路介导调控EMT过程，SATB1是否在细胞生物学水平直接影响直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡等生物学行为，还有待进一步研究。

结合RT-qPCR及Western blotting在中低位直肠癌手术患者标本切缘及区域淋巴结的检测结果及患者的预后情况，作者分析ATB1表达可能通过Snail/Slug信号通路抑制E-cadherin而介导中低位直肠癌上皮-间质转化（EMT）的发生。在常规病理学检测为阴性的中低位直肠癌手术标本的切缘及区域淋巴结组织中，SATB1的过表达可作为评估患者肿瘤预后的危险因素，并进一步评估肿瘤分期分级及患者肿瘤负荷来预测组织发生肿瘤微转移，提示患者发生肿瘤局部复发或远处转移风险，指导患者术后行放、化疗、靶向及免疫治疗等肿瘤综合治疗的必要性，为提高直肠癌个体化综合治疗精准性提供新的理论依据。