miR-34a对肾癌细胞增殖 侵袭的调控机制分析

胡文豪 丛玲华

肾癌是肾实质内肾小管上皮系统病变导致，具有发病率高、晚期预后差等特点，严重威胁患者生命健康安全［1］。其发病率仅次于膀胱癌，居泌尿系统恶性肿瘤第二位［2-3］。随着分子生物学、靶向医学、基因组织学不断发展，研究发现人体miRNA存在抑癌基因，具有较高的调控癌基因作用，在机体肾癌组织细胞内表达异常，能对肾癌细胞增殖、侵袭能力有效调节和管控，进而提升患者预后生存质量［4］。miR-34a作为miRNA家族中最重要的成员之一，与肾实质肿瘤组织细胞增殖、侵袭关系密切，全程参与肾癌细胞发育、增殖、侵袭及凋亡过程，具有较高的研究价值［5］。本研究探讨miR-34a对肾癌细胞增殖和侵袭能力的影响，以期为肾癌的临床治疗和预后评估提供靶向理论依据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料采集 选择2019年4月至2020年3月本院手术切除获得的肾癌组织标本、肾癌旁组织标本30例，均由病理科医师通过严格的病理实验鉴定、确诊。患者于术前均未行全身治疗，手术切除组织样本后立即置入液氮环境下冻存。本项目经本院伦理委员会批准，患者均知情并签署同意书。

1.2 仪器和设备 Real-time PCR仪（型号：7300），购自美国应用生物系统公司；超低温冰箱（型号：MDF-382E），购自日本SANYO；光学显微镜，购自重庆光学仪器厂；电子天平，凯丰电子天平仪器有限公司；电热恒温水浴锅（型号：DK-S26），购自上海精宏实验设备公司；全自动生化分析仪，购自美国麦克公司；PCR仪（型号：PC-808），购自日本ASTEC公司；AB SCIEX QTRAP 6500液-质联用仪，购自美国AB SCIEX公司；高速离心机（型号：TGL-16C），购自湖南星科科学仪器有限公司。

1.3 方法 （1）细胞培养、转染：①细胞培养：经RPMI 1640培养基（内含10%胎牛血清）开展人肾癌细胞、癌旁组织细胞培养，在37℃的二氧化碳（浓度5%）培

养箱内培养，每间隔2 d对培养基进行更换，若细胞汇合>80%开展传代培养。②细胞转染：于转染前1 d，将肾癌细胞准确接种在6孔板内，选择无抗生素的无菌培养基实施细胞培养；在细胞密度显示为70%~80%情况下，依据Lipofectamine 2000试剂盒的说明书实施细胞转染操作，转染6 h后将6孔板中培养基取出，并加入RPMI 1640培养基，内含10%胎牛血清。再于37℃的二氧化碳（浓度5%）培养箱内正常培养。（2）miR-34a表达检测及分组：提取肾癌细胞总RNA，经荧光定量PCR法检测肾癌组织细胞miR-34a表达，严格按说明书实施操作。根据miR-34a表达（中位数：1.02×106）分为miR-34a高表达组（>1.02×106）、miR-34a低表达组（<1.02×106）［6］。（3）MTT法检测肾癌细胞增殖能力：采用MTT法（四唑盐比色法）对肾癌细胞活力进行检测，转染后经0.25%胰酶开展消化离心处理，将5×103个细胞准确接种在96孔板内，设定每孔为200 ml，于37℃的二氧化碳（浓度5%）培养箱内行3~4 h培养，后于每孔内加入DMSO（150 ml），充分振荡5~10 min，使晶体充分溶解，并经酶标仪对490 nm波长处每孔吸光度值进行测定、记录［7］。（4）Transwell法测定肾癌细胞侵袭能力：选择Matrigel基质胶，通过培养基（内无胎牛血清）根据9∶1比例稀释，于37℃条件下过夜凝固。同时在转染培养48 h后经胰蛋白酶消化，将细胞密度调整成4×105/ml，并将200 ml准确加入小室上室，再将培养液（内含20%胎牛血清）600 ml加入下室，于37℃条件下培养24 h，将小室准确取出，利用甲醛固定，发现结晶呈紫染色，于显微镜下观察、拍照，对穿膜细胞数进行计数［8］。（5）预后生存质量随访：对患者进行12个月随访，对患者预后生存时间进行分析，评估肾癌组织细胞miR-34a表达与患者预后的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验；计数数据用n（%）表示，组间比较用χ2检验，选择Kaplan-Meier生存模型分析患者预后，绘制生存曲线图，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织与癌旁组织细胞内miR-34a相对表达比较 见表1。

表1 肾癌组织与癌旁组织细胞内miR-34a相对表达比较（±s）

表1 肾癌组织与癌旁组织细胞内miR-34a相对表达比较（±s）

组别 n miR-34a相对表达癌旁组织细胞 30 1.78±0.22肾癌组织细胞 30 0.84±0.13 t值 20.148 P值 <0.01

2.2 不同时间段肾癌组织细胞吸光度值比较 见表2。

表2 不同时间段肾癌组织细胞吸光度值比较（±s）

表2 不同时间段肾癌组织细胞吸光度值比较（±s）

组别 n 12 h 24 h 48 h miR-34a低表达组 30 4.25±0.37 24.69±7.06 42.81±10.09 miR-34a高表达组 30 4.21±0.26 16.65±4.12 30.16±9.04 t值 4.746 8.061 3.213 P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 miR-34a对肾癌细胞侵袭能力的影响 见表3。

表3 miR-34a对肾癌细胞侵袭能力的影响（±s）

表3 miR-34a对肾癌细胞侵袭能力的影响（±s）

组别 n 肾癌侵袭细胞数miR-34a低表达组 30 142.89±11.44 miR-34a高表达组 30 87.14±9.23 t值 20.774 P值 <0.01

2.4 肾癌组织细胞miR-34a表达与患者预后的相关性 miR-34a高表达组患者的无复发生存率明显高于miR-34a低表达组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 不同miR-34a表达肾癌患者预后生存曲线图

3 讨论

随着生活方式改变，肾癌患病率逐年增高，对患者生命健康存在严重危害［9］。miR-34a作为高度保守miRNA，在哺乳动物体内广泛分布，存在组织特异性，于肺以外组织内广泛分布。研究显示，miR-34a存在抑癌作用，能抑制肝癌、乳腺癌等相关肿瘤，故认为miR-34a能明显影响肾癌［10］。本研究结果显示，相比癌旁组织，肾癌组织细胞内miR-34a表达明显下降。经MTT法、Transwell法对miR-34a、靶基因干扰肾癌组织细胞增殖、凋亡进行分析，结果表明miR-34a可明显抑制肾癌组织细胞的增殖、侵袭能力，并加速肾癌肿瘤细胞的凋亡进程［11］。miR-34a通过对肾实质肿瘤细胞的增殖、侵袭平衡作用进行调节和管控，加速肿瘤细胞因子的凋亡周期，进而维持人体中肿瘤细胞数量的相对稳定［12］；一旦机体内肿瘤细胞出现增殖、凋亡平衡紊乱，侵袭能力不受控制，即可诱发恶性肿瘤疾病，因此临床治疗肾癌过程中，需要对癌细胞增殖、侵袭能力进行有效抑制，诱导肾癌细胞加速凋亡，进而缩小肿瘤组织病症体积，改善患者预后质量［13-14］。

目前，临床主要通过大剂量化疗药物抑制肾肿瘤细胞的增殖、侵袭能力，通过强毒性化学药物输注人体杀灭肿瘤细胞，诱导癌细胞凋亡进程，进而发挥抗肿瘤治疗作用［15］。持续性全身化疗疗法虽然具有一定的临床治疗效果，能够有效杀灭肿瘤细胞因子，抑制癌细胞的快速增殖和侵袭，延长患者生存时间。但大多数化疗药物均具有较高的毒副作用，长期持续性输注化疗药物会给患者带来严重不良反应，降低患者预后生存质量［16］。近年来，随着生物靶向医学研究的不断发展，研究发现miR-34a经对凋亡通路有关基因进行调控，能诱导细胞凋亡。本研究结果表明，经Transwell法明确miR-34a高表达可对肾癌组织细胞侵袭能力存在抑制作用，进而加速肿瘤细胞凋亡进度；提示miR-34a表达过度可增加细胞凋亡标志蛋白-PARP降解产物表达，miR-34a可将细胞凋亡通路激活，削弱肿瘤细胞的侵袭能力，加快肾癌组织细胞凋亡［17］。研究发现，细胞凋亡信号通路较多，miR-34a激活的具体细胞凋亡信号通路有待深入研究。Notch1信号转导通路主要由CSLD-NA结合蛋白、Notch受体及Notch配体构成，参与细胞增殖、分化活动，能对细胞分化及增殖、凋亡进行调节，影响细胞生理及病理过程。大量研究表明，Notch信号存在促肿瘤作用，肿瘤细胞组织内Notch表达明显高于正常组织，与肿瘤增殖、凋亡关联密切［18-19］。本研究结果显示，miR-34a高表达组患者无复发生存率明显高于miR-34a低表达组；提示miR-34a高表达能够提高肾癌患者的无复发生存率，改善预后生存质量。miR-34a 通过靶向机体内的多种mRNA，控制肾癌肿瘤细胞的周期、抑制细胞增殖、侵袭能力，进而有利促进人体DNA的修复进程。与此同时，miR-34a还能够调控肾癌干细胞的恶性表达，通过诱导肿瘤细胞周期停止在S期，进一步影响肾实质肿瘤的恶性生物学行为，最终提高患者的无复发生存率。

综上所述，miR-34a通过靶向调控肾癌细胞增殖、侵袭能力，对机体肾癌肿瘤细胞的凋亡进行诱导，进而阻断细胞增殖、分化进程；miR-34a高表达能够提高患者预后生存质量，可作为肾癌临床预后评估的靶向肿瘤标志物。