2型糖尿病患者视网膜病变与血浆氧化三甲胺水平的相关性分析

武银铃, 朱丽晔, 章 雯, 桂雅迪, 王 雷, 杨 芬, 孙树乾

(江苏省南京市溧水区人民医院/东南大学附属中大医院溧水分院,1. 内分泌科, 2. 康复医学科, 江苏 南京, 211200)

糖尿病视网膜病变(DR)是导致中老年糖尿病患者视力损害的主要原因之一，其全球患病率约为34.6%[1]。高血压、糖尿病病程较长、血糖控制不佳是DR发生和发展的重要危险因素，探讨能准确反映DR病情的生物标志物有助于制定高危人群的早期预防和个性化管理策略。氧化三甲胺(TMAO)是一种由肠道微生物衍生的代谢物，主要来源于左旋肉碱、胆碱及前体三甲胺(TMA)。肠道微生物群将L-肉碱和胆碱转化为TMA, TMA在肝脏中被黄素单加氧酶3(FMO3)氧化为TMAO。既往研究[2-4]证实，血浆TMAO是心血管疾病预后的一个新预测因子，非致死性抑制肠道微生物酶或FMO3基因缺陷可显著降低TMAO水平，减轻TMAO诱导的动脉粥样硬化和血栓形成性疾病。一项荟萃分析[5]结果显示，血浆TMAO浓度与糖尿病的发生风险呈正相关。较高TMAO浓度会损害葡萄糖的稳态，导致糖尿病并发症的发生和较差的临床预后[6]。此外，FMO3基因敲除可以降低血浆TMAO浓度，进而预防高脂血症和高血糖疾病的发生[7]。TMAO可能是糖尿病相关性疾病的一个重要新型生物标志物，但目前关于TMAO与DR之间关系的研究较少。本研究分析了血浆TMAO水平与2型糖尿病(T2DM)患者DR的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年10月—2020年10月在本院就诊的102例T2DM患者作为研究对象，根据有无DR和DR分期标准[8]将患者分为无DR(NDR)组38例、非增殖性DR(NPDR)组35例、增殖性DR(PDR)组29例。NDR组男22例，女16例，年龄57～67岁; NPDR组男19例，女16例，年龄56～66岁; PDR 组男17例，女12例，年龄57～67岁。另选取本院同期40名健康体检者作为对照组，男25例，女15例，年龄56～66岁。4组受试者性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准: ① T2DM的诊断符合1999 年世界卫生组织糖尿病的诊断和分型标准[9]者; ② 受试对象或家属自愿参加本研究，并签署知情同意书。排除标准: ① 患有其他眼部疾病者，如外伤、青光眼、白内障、视网膜脱落; ② 合并严重肝肾功能障碍、认知障碍、自身免疫性疾病、全身感染、恶性肿瘤、意识障碍、糖尿病急性并发症者; ③ 近1个月口服降脂药物者; ④妊娠期、哺乳期女性。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集: 收集受试者的性别、年龄、体质量指数(BMI)、糖尿病病程和高血压、冠心病、糖尿病肾病病史等一般资料。

1.2.2 实验室指标检测: 实验室指标包括空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血肌酐、C反应蛋白(CRP)和TMAO。采集受试者清晨空腹静脉血5 mL, 分2管进行EDTA抗凝处理，一管用于常规生化指标检测，另一管用于TMAO检测。经4 ℃、3 000转/min离心10 min, 静置提取血浆后于-80 ℃保存集中送检。采用同位素稀释液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法检测血浆TMAO浓度[10], 将20 μL血浆样品与80 μL含有d9-TMAO(上海Sigma公司)甲醇内参溶液混匀后在15 000转/min、4 ℃条件下离心10 min, 取70 μL上清液在API 5500Q-TRAP(美国AB SCIEX公司)质谱仪上进行检测。其他血脂、血糖和生化指标采用美国Beckman Coulter公司DxC800自动生化分析仪检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 一般资料和实验室指标比较

PDR组患者糖尿病病程长于NDR组、NPDR组患者，差异有统计学意义(P<0.05); 对照组、NDR组、NPDR组、PDR组的FPG、HbA1c、CRP和TMAO水平均依次升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组临床资料和实验室指标比较

2.2 不同TMAO水平亚组患者一般资料和实验室指标的比较

按不同TMAO水平将受试者(n=142)分为<0.3 μmol/L组、0.3～0.6 μmol/L组和>0.6 μmol/L组3个亚组, 3组间糖尿病病程和FPG、HbA1c、CRP水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同TMAO水平亚组患者一般资料和实验室指标比较

2.3 TMAO与各临床参数的相关性分析

Spearman相关分析结果显示, TMAO与糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP均呈显著正相关(r=0.456、0.568、0.623、0.774,P均<0.05), 与其他临床参数无显著相关性(P>0.05)。见表3。

表3 TMAO与各临床参数的相关分析

2.4 DR的主要危险因素分析

Logistic回归分析结果显示，糖尿病病程长和FPG、HbA1c、CRP、TMAO水平高均是DR的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 DR的主要危险因素分析

2.5 3种方法对DR的诊断效能比较

ROC曲线分析结果显示，单独TMAO诊断DR的曲线下面积(AUC)为0.833, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP联合诊断DR的AUC为0.802, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP、TMAO联合诊断DR的AUC为0.879。见表5、图1。

表5 3种方法对DR的诊断效能比较

图1 3种方法诊断DR的ROC曲线

3 讨 论

TMAO的表达与糖尿病和DR的发生密切相关。研究[11]表明，TMAO对葡萄糖代谢有负性调节作用，进而导致糖尿病的发生。与健康人相比，糖尿病患者磷脂酰胆碱水平与全因死亡率以及心血管疾病病死率有较强的相关性[12]。血清TMAO水平升高与胰岛素抵抗、内脏肥胖和脂肪肝的发生也有紧密联系，而干预生活方式可以降低TMAO水平[13-14]。CROYAL M等[15]提出，年龄、糖尿病和BMI与血浆TMAO水平相关，与左旋肉碱无关。这些改变不仅与血脂的甲基化有关，而且与高水平血糖有关，因此认为高水平血浆TMAO是糖尿病的一个有力预测指标。研究[16-18]发现，高TMAO水平是糖尿病患者不良心血管结局的标志，如死亡(HR=2.7, 95%CI为1.1～7.1)、心肌梗死(HR=4.0, 95%CI为1.6～9.8)、心力衰竭(HR=4.6, 95%CI为2.0～10.7)、不稳定型心绞痛(HR=9.1, 95%CI为2.8～29.7)和其他心血管事件(HR=2.0, 95%CI为1.1～3.6)。BARREA L等[19]研究结果显示，在T2DM患者中，血浆TMAO水平升高导致3年主要心脏不良事件风险增加3.0倍(P<0.001), 5年病死率风险增加3.6倍(P<0.001)。

本研究结果显示, PDR组患者糖尿病病程长于NDR组、NPDR组患者，差异有统计学意义(P<0.05); 对照组、NDR组、NPDR组、PDR组的FPG、HbA1c、CRP和TMAO水平依次升高，差异有统计学意义(P<0.05); TMAO与糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP呈显著正相关(P<0.05)，与年龄、糖尿病持续时间无相关性，与其他研究[20]结论不一致，考虑与样本量有限和选择偏差有关。高脂肪饮食相较素食会产生更多的TMAO[21]。T2DM患者血浆TMAO水平明显升高，且随着DR的发生和发展, TMAO水平逐渐升高，表明TMAO在糖尿病及其并发症的发生发展中发挥着重要作用。Logistic回归分析结果显示，糖尿病病程长和FPG、HbA1c、CRP、TMAO水平高是DR的主要危险因素(P<0.05); ROC曲线分析结果显示, TMAO诊断DR的曲线下面积(AUC)为0.833, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP联合诊断DR的AUC为0.802, 糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP、TMAO联合诊断DR的AUC为0.879。由此提示, TMAO联合糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP对DR有较好的诊断效能。动物实验[22-23]结果显示，糖尿病小鼠肠道菌群失调可促进DR的发生，间歇性禁食可通过重组肠道微生物组群来阻止DR进展，增加硬壁菌数量，减少拟杆菌，而血浆TMAO水平与硬壁菌呈负相关，与拟杆菌呈正相关。研究[24]提示, TMAO通过增强胰岛素抵抗和血脂异常参与DR的发生，血浆TMAO水平越高，胰岛素抵抗越强，糖尿病相关预后越差。炎症是影响DR进展的关键，血浆TMAO水平升高可导致轻度和慢性全身炎症状态，引起血浆促炎细胞因子水平升高[25-26]。有动物实验[27]采用高脂肪饮食喂养小鼠后，发现小鼠血浆TMAO浓度较高，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平升高，白细胞介素-10(IL-10)水平降低。此外, TMAO可激活炎症信号通路，促进白细胞募集[28], 提示TMAO可能通过促进活性氧(ROS)的过度生成和抑制Sirtuin1的表达，从而加速内皮细胞衰老[29]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)也可能参与了TMAO诱导的血管内皮细胞通透性变化过程，以及参与DR的发生过程[30]。

综上所述，血浆TMAO水平升高与T2DM患者DR的发生及其严重程度有关，是DR的主要危险因素之一。TMAO联合糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP对DR有较高的诊断效能。但本研究存在一定局限性，如为单中心研究且样本量较小，也缺乏动物或细胞基础研究对相关假设机制进行验证，此外血浆TMAO浓度可能存在多种影响因素(如饮食习惯、胃肠道疾病、应用抗生素以及检测技术的精确度等)，故有待开展更多实验以及多中心、大样本量的临床研究进一步探讨。