小麦粉中2种新型真菌毒素含量测定方法

周贻兵，李磊，吴玉田，刘利亚*

贵州省疾病预防控制中心（贵阳 550004）

真菌毒素是农产品的主要污染物质之一，且随着气候变化，产毒真菌谱及真菌毒素发生显著变化，新兴真菌毒素不断被发现，成为世界各国高度关注的食品安全热点问题[1]。新兴真菌毒素白僵菌素（BEA）和恩镰孢菌素B（ENB）是由镰刀菌属真菌侵染小麦、玉米等农作物后，在潮湿和低温条件下产生的环状六缩酚酸肽类真菌毒素[2-3]。BEA和ENB能提高阳离子穿过细胞膜能力，由此干扰正常生理水平下细胞的阳离子水平、影响细胞膜的电化学梯度，而产生细胞毒性、免疫毒性、血液等方面毒性[4-5]。国内并无2种新兴毒素检测国家标准，给农产品中BEA和ENB污染状况调查带来难度，因此，建立小麦粉中BEA和ENB准确、可操作性强的检测方法为农产品检测提供参考。

农产品中真菌毒素常使用混合溶剂提取，采用QuEChERS法、免疫亲和柱、多功能净化柱、固相萃取柱等净化方法有效降低基质影响，使用液相色谱或液相色谱质谱法进行检测[6-14]。在综合文献基础上，结合面粉基质干扰情况，采用PEP固相萃取柱净化，对待净化液、淋洗液中乙腈比例进行优化，建立UPLC-MS/MS检测小麦粉中BEA和ENB这2种新兴真菌毒素含量，为分析小麦粉中BEA和ENB这2种新兴真菌毒素污染现状提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000-TSQ Quantum Ultra超高压液相色谱-三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）（美国Thermo公司）；3-18K台式高速离心机（Sigma中国有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国密理博公司）；IKA MS3涡旋混均仪（德国IKA公司）；T 460 H型超声波清洗器（北京博励行仪器有限公司）。

乙腈、甲酸（色谱纯，美国Thermo公司）；乙酸铵（LC-MS级，阿拉丁试剂上海有限公司）、氨水（优级纯，上海国药集团化学试剂有限公司）；PEP固相萃取柱（200 mg 6cc，美国Thermo公司）；MycoSep 226、MycoSep 227、MycoSep 228多功能净化柱（Romer国际贸易有限公司）；实验用水为一级水；白僵菌素标准品和恩镰饱菌素B标准品（青岛普瑞邦生物工程有限公司）。

白僵菌素标准品贮备液（1 mg/mL）：取10 mg白僵菌素标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。

白僵菌素标准溶液（100 μg/mL）：准确吸取1.00 mL质量浓度1 mg/mL白僵菌素标准贮备液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得质量浓度100 μg/mL白僵菌素标准溶液。

白僵菌素和恩镰孢菌素B混合标准溶液：分别准确吸取质量浓度均为100 μg/mL白僵菌素和恩镰饱菌素B标准溶液1.00 mL和0.50 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，备用。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm，Waters公司）；柱温35 ℃；进样体积5 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液；流动相B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5 min 95% A，0.5～7.5 min 95%的A线性变化为10%，7.5～11 min 10% A，11.1～14 min 95%A；流速0.3 mL/min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾（ESI+）离子源；喷雾电压3 500 V；毛细管温度300 ℃；蒸发温度300 ℃；鞘气压力273 kPa；辅助气102 kPa；碰撞气0.2 Pa；多反应监测（MRM）优化参数见表1。

表1 质谱参数

1.3 样品提取与净化

准确称取5 g（精确至0.01 g）样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入30 mL乙腈-甲酸-水（体积比84︰1︰15）溶液，涡旋混匀，超声提取30 min，涡旋提取1 min，以10 000 r/min离心5 min，转移提取液于50 mL刻度离心管中，加入10 mL乙腈-甲酸-水（体积比84︰1︰15）溶液重复提取1次，离心，合并提取液，用乙腈-甲酸-水（体积比84︰1︰15）溶液定容至40 mL，混均，准确吸取10 mL提取液于50 mL刻度离心管中，加入15 mL水稀释，混均，待净化。将样品待净化液经6 mL甲醇和6 mL水活化后的PEP固相萃取柱净化，3 mL乙腈-水溶液（体积比40︰60）淋洗并抽干固相萃取柱，用3 mL乙腈均分2次洗脱PEP固相萃取柱，收集洗脱液，混均，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 监测模式的选择

BEA和ENB 2种新兴真菌毒素分子式分别为C45H57N3O9和C33H57N3O9，相对分子质量为783.4和639.4，BEA在N-甲基-氨基酸残基上具有苯基，ENB在相同位置上具有异丙基，均为环状六缩酚酸肽类结构，在液质中易于离子化。在甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相、0.3 mL/min流速条件下，以10 μL/min通过针泵将质量浓度均为0.5 μg/mL BEA和ENB这2种新兴真菌毒素注入质谱仪器中，采用正离子和负离子模式进行全扫描，BEA和ENB均在ESI+模式下响应信号远高于ESI-模式下响应信号，所以选择ESI+模式检测2种新兴真菌毒素。比较ESI+模式下BEA和ENB的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+、[M+NH4]+的响应情况，结果发现，BEA和ENB这2种真菌毒素[M+H]+响应值＞[M+NH4]+响应值＞[M+Na]+响应值＞[M+K]+响应值。同时，考察甲醇-5 mmol/L的醋酸铵水溶液为流动相条件下，BEA和ENB的响应情况，结果发现BEA的[M+H]+响应值＞[M+NH4]+；ENB的[M+H]+响应值＜[M+NH4]+响应值，但[M+NH4]+与甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相条件下的[M+H]+响应无显著提高，且以[M+NH4]+为准分子离子进行碰碎，响应高、稳定的碎片离子为m/z640.7，196.0和214.1，而m/z640.7是ENB的[M+H]+离子之间相互串扰，影响定量，所以综合考虑选择甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相，BEA和ENB这2种新兴真菌毒素均以[M+H]+准分子离子为母离子进行碰碎，进行二级质谱扫描，选择响应较高、稳定且干扰较小的2个碎片离子构成监测离子对，同时对透镜电压、碰撞能量等质谱条件进行优化，优化后的质谱条件见表1。

BEA和ENB这2种新兴真菌毒素极性较弱，在反相C18色谱柱上保留较强，采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱，BEA和ENB标准的TIC图谱见图1。

2.2 样品提取液的优化

农产品中真菌毒素常采用乙腈、甲醇、乙腈-水、甲醇-水、酸化乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈-水和酸化的甲醇-水溶液提取。因为小麦粉中淀粉和蛋白等组分在提取过程中易发生交联而影响毒素提取效果，所以在提取过程中需加水浸泡展开提高提取效率。BEA和ENB极性弱，仍采用真菌毒素常用的提取溶剂乙腈-水（体积比84︰16）混合溶液提取2种新兴毒素，同时比较含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液与未酸化的乙腈-水溶液对2种新兴毒素的提取回收率，结果表明，小麦粉中BEA采用含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取回收率（76.25%～99.31%）略高于未酸化乙腈-水溶液的回收率（72.15%～98.93%），而ENB采用含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取回收率（74.60%～91.17%）略低于未酸化乙腈-水溶液的回收率（76.85%～93.67%）；相同浓度下ENB的响应高于BEA的响应，为了2种新兴毒素同时检测，优先满足灵敏度低BEA响应，综合考虑选择含1%甲酸酸化的乙腈-水溶液提取小麦粉中BEA和ENB这2种新兴真菌毒素。

图1 标准的TIC图谱

2.3 净化方法、待净化液、淋洗液中乙腈比例和洗脱液乙腈用量的优化

小麦粉样品基质的存在影响BEA和ENB离子化效率，需采用一定净化方法减小基质的影响。真菌毒素常采用特异性强、回收率高的免疫亲和柱净化，净化效果较佳，但BEA和ENB这2种新兴毒素缺乏商品化市售免疫亲和柱。文献报道，采用快速QuEChERS法净化，BEA和ENB这2种新兴真菌毒素的基质标曲与溶剂标曲斜率比值分别为0.744和0.526，仍存在较强基质抑制效应，净化效果不佳[11]。分析吸附杂质型多功能净化柱MycoSep 226、MycoSep 227、MycoSep 228净化效果，结果表明，3种多功能柱均吸附BEA和ENB这2种新兴真菌毒素，吸附率在90%以上，不适用于小麦粉中BEA和ENB的净化。考察对极性和非极性化合物均有保留且回收率受柱床干涸影响较小的PEP固相萃取柱净化效果，BEA和ENB这2种新兴真菌毒素的低、中、高3个浓度水平的回收率分别在76.25%～99.31%和74.60%～91.17%，满足小麦粉中痕量BEA和ENB检测。对比待净化液中乙腈含量对BEA和ENB这2种新兴真菌毒素回收率影响，结果表明，随着乙腈比例增加，2种新兴真菌毒素在PEP柱上保留特性显著提高，但待净化液中乙腈比例超过40%后，PEP固相萃取柱对BEA和ENB这2新兴真菌毒素保留下降，所以采用PEP固相萃取柱净化时，应将样品提取液进行稀释，乙腈比例控制在30%～40%，保证PEP固相萃取柱对BEA和ENB最佳保留效果。对比淋洗液中不同比例乙腈-水溶液对BEA和ENB这2种新兴真菌毒素回收率影响，结果表明淋洗液中乙腈比例越高，淋洗杂质效果越好，基质抑制越弱，但淋洗液中乙腈比例超过40%，BEA和ENB被部分洗脱，回收率下降，淋洗液中乙腈比例50%时，ENB回收率降至80%以下，采用40%乙腈-水溶液，淋洗杂质，减少基质的干扰。考察洗脱液乙腈用量，采用1.5 mL乙腈洗脱固相萃取柱中的BEA和ENB时，2种新兴真菌毒素洗脱率在96%左右，目标物洗脱不完全，所以加入1.5 mL乙腈洗脱对目标物进行洗脱，保证2种新兴真菌毒素洗脱完全。

2.4 基质效应的考察

食品样品基质复杂，在UPLC-MS/MS分析中不可避免产生基质效应，表现为基质增强或基质抑制。采用基质标准溶液曲线斜率和溶剂标准溶液曲线斜率之比（K）评价基质效应，K大于1时为基质增强效应，K小于1时为基质减弱效应，K等于1时无基质效应，结果表明，BEA和ENB这2种新兴真菌毒素使用PEP固相萃取柱净化后的小麦粉空白基质溶液配制标准曲线和溶剂标准曲线斜率比分别为0.945和0.922，即基质抑制效应在可接受范围内，为提高小麦粉中BEA和ENB定量结果准确性，仍采用基质匹配的标准曲线定量。

2.5 标准曲线与定量限

将BEA和ENB这2种新兴真菌毒素混合标准溶液逐级稀释，用小麦粉样品空白净化基质溶液配制成BEA质量浓度为0，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0和50.0 ng/mL以及ENB质量浓度为0，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，15.0，20.0和25.0 ng/mL基质匹配标准曲线，在优化的仪器工作条件下进样分析，以质量浓度（x）为横坐标、响应值峰面积（Y）为纵坐标绘制基质匹配的标准曲线，BEA和ENB基质匹配标准曲线回归方程分别为YBEA=2.71×105x+1.67×104（r=0.999 5）、YENB=6.17×105x+7.25×104（r=0.999 7），2种新兴真菌毒素在相应的浓度范围内线性关系良好，以S/N=10计算方法定量限，结果分别为3和1.5 μg/kg。

2.6 方法精密度和回收率试验

在空白样品中加入定量限附近、标准曲线中间点和高浓度点验证方法的准确性，选择在空白小麦粉样品中加入BEA质量浓度为4.8，48和96 μg/kg，结果ENB质量浓度为2.4，24和48 μg/kg低、中、高3个浓度水平的2种新兴真菌毒素标准品，涡旋混均，放置30 min，使其样品基质与标准品充分接触，按照1.3的样品前处理进行处理及测定，每个添加浓度水平测定6份平行样，方法加标回收率及重现性相对标准偏差结果见表2。

由表2可知，BEA和ENB测定方法平均回收率分别为76.25%～99.31%和74.60%～91.17%，小麦粉中方法的重现性相对标准偏差低于10%。与韩小敏等[15]文献报道的小麦粉中BEA和ENB回收率分别为100.5%～126.0%和114.6%～123.1%相比偏低，但考察BEA和ENB加标回收率低端浓度水平分别为50和20 μg/kg，是定量限192倍（BEA定量限0.26 μg/kg）和400倍（ENB定量限0.05 μg/kg），不能准确反映出定量限附近方法的准确度，所以试验考察定量限附近方法的加标回收率，BEA和ENB低、中、高3个浓度水平的加标回收率均大于70%，满足痕量真菌毒素的分析要求。

表2 方法加标回收率及精密度结果（n=6）

2.7 实际样品测定

应用试验方法对超市随机购买的10批次小麦粉中BEA和ENB进行检测，其中2批次样品检出白BEA，含量分别为3.69和5.73 μg/kg；1份检出ENB，含量为4.42 μg/kg。

3 结论

建立基于PEP固相萃取柱净化、基质匹配标准曲线定量、超高效液相色谱-串联质谱检测小麦粉中BEA和ENB这2种新兴真菌毒素测定方法。BEA和ENB这2种新兴毒素分别在0～50 ng/mL和0～25 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。在空白样品中添加低、中、高3个浓度水平的BEA和ENB标准品，平均回收率均大于70%，方法重现性相对标准偏差小于10%，采用PEP固相萃取柱净化，有效降低小麦粉中样品基质的影响，适用于小麦粉中痕量BEA和ENB这2种新兴真菌毒素检测，为分析小麦粉中BEA和ENB污染水平提供参考依据。