胞红蛋白调控血管平滑肌表型转换与高血压血管重建机制研究

赵枫萍 徐醇芳 严志强 张小琴

(上海交通大学附属第六人民医院南院上海市奉贤区中心医院，上海 201499)

原发性高血压是一种复杂的多因素疾病，其主要发病机制之一是外周血管功能和结构异常。近年来发现，胞红蛋白(cytoglobin, Cygb)作为最新发现的珠蛋白之一，与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)病理生理机制的调控相关性逐渐引起人们的关注[1]。高血压病理性血管重建主要病理特征是VSMCs增殖、迁移、表型转换和细胞外基质分泌功能活跃[2]。原发性高血压引起的大动脉重建是一种外向型的肥厚性重建，包括动脉内腔扩大、中膜增厚、胶原沉积、顺应性降低。其中动脉壁增厚被认为是维持血管壁应力的主要代偿机制之一。本研究观察胞红蛋白调控血管平滑肌细胞表型转换与高血压血管重建机制，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2020年6月我院实验中心饲养12周龄雄性SD大鼠30只，体质量(200±20)g。

1.2方法

1.2.1Cygb在高血压与正常大鼠颈动脉的差异表达 (选取12周龄大鼠30只，分为3组：肾动脉缩窄高血压药物组、肾动脉缩窄高血压组、正常对照组；高血压药物组大鼠用血管紧张素Ⅱ一型受体(AT1R)拮抗剂阿利沙坦酯灌胃，术后每天测定尾动脉血压，血压升高后给药使大鼠尾动脉血压降低达到正常血压后，每周测定一次血压；血压正常四周后，取颈动脉，部分石蜡包埋，部分匀浆后提取蛋白、总RNA。(1)石蜡包埋组织切片后，石蜡包埋切片形态学检测血管重建指标如壁厚，中膜-内径比；免疫组化染色，检测Cygb的定位与表达。(2)提取的蛋白进行免疫印迹检测，检测Cygb蛋白在不同血管组织中的表达水平。(3)提取的总RNA，逆转录为cDNA后，做荧光定量PCR，检测Cygb mRNA的表达。

1.2.2Cygb对血管平滑肌细胞表型转换的影响 (Ang-II处理培养血管平滑肌细胞：无菌条件下将四周龄的SD大鼠颈动脉取出，仔细去除动脉周围的结缔组织和外膜，将血管纵向剪开，用无菌棉签去除内膜层的内皮细胞后，再用虹膜剪将血管剪成小于1 mm 3大小的组织块，置入60 mm的培养皿，贴壁后，添加含20%胎牛血清的DMEM培养基，每隔三天换一次液，至细胞长出后传代，用ɑ-actin和SM-22免疫荧光技术鉴定其纯度，纯度>95%可用于后续实验。VSMCs中加入Ang-II(浓度为10-6M/L)；测定Ang II对VSMCs增殖和h-caldesmon、(-actin、calponin、SM -22、(和( -tropmyosins以及SM-MHC等表型分子表达的影响；(Cygb表达变化对血管平滑肌细胞表型转换的影响：通过构建Cygb过表达和RNA干扰慢病毒质粒系统转染VSMC来改变Cygb的表达状态，CCK-8、Edu细胞增殖试剂盒、流式细胞仪测定VSMC的增殖、细胞周期；RT-PCR、免疫印迹检测h-caldesmon、(-actin、calponin、SM -22、(和( -tropmyosins以及SM-MHC等细胞分化标志蛋白和的表达变化，以及Anxa8、Tpm3h和Retnlb等信号分子表达变化。明确Cygb对VSMC型转换、增殖与分化的作用。

1.2.3在体转染Cygb研究对高血压大鼠颈总动脉功能及形态学研究影响 (1)在体转染高血压大鼠颈动脉Cygb，1月后部分组织用于形态学检测(方法同上)，部分用于血管电生理检测；(2)应用wire myography观察Cygb对高血压大鼠颈总动脉肌张力变化：a.分离正常对照的高血压大鼠、肾性高血压大鼠和用CYGB慢病毒转染的肾性高血压大鼠颈总动脉，固定于张力电极(具体方法略);b.PSS血管平衡6次，15 min/次，共计90 min；c.KPSS激活血管三次，间隔5 min/次；d.加入NE(去甲肾上腺素)3.3uL，后加入卡巴胆碱10 mmol/L、100 mmol/L，观察血管肌张力曲线；e.加入AngII 10-6Mol/L 6uL温浴30 min后，方法同c，观察AngII存在条件下血管肌张力曲线；(3)应用pressure myography观察Cygb对高血压大鼠颈总动脉压力-直径变化关系：a.分离正常对照的高血压大鼠、肾性高血压大鼠和用CYGB慢病毒转染的肾性高血压大鼠颈总动脉，固定于玻璃电极；b.从0～100 mmHg，每10 mmHg递增压力梯度，观察压力-直径变化；c.先加入NE(去甲肾上腺素)3.3uL，后加入卡巴胆碱10 mmol/L、100 mmol/L，观察血管直径变化时间曲线；d.先加入AngII 10-6Mol/L 6uL温浴30 min后，方法同c，观察AngII存在条件下血管直径变化时间曲线。

1.3观察指标 观察三组大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表达变化；观察正常血压主动脉与高血压主动脉大鼠模型术后6周血管重建后Cygb mRNA表达水平。

2 结 果

2.1观察三组大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表达变化 肾动脉缩窄高血压药物组、肾动脉缩窄高血压组的Anxa8、Tpm3基因表达显著高于正常对照组，Rentn1b基因表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而肾动脉缩窄高血压药物组的Anxa8、Tpm3基因表达显著低于肾动脉缩窄高血压组，而Ren1b基因表达显著高于肾动脉缩窄高血压组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组大鼠Anxa8、Tpm3、Retn1b mRNA基因表达变化

2.2正常血压主动脉与高血压主动脉大鼠模型术后6周血管重建后Cygb mRNA表达水平比较 肾性高血压大鼠模型术后六周血管重建后Cygb的表达差异初步研究，发现与正常血压主动脉组比较，高血压大动脉中Cygb的mRNA表达下降(P<0.05)，见图1。

2.3比较三组大鼠颈动脉Cygb mRNA与中膜厚度指标 肾动脉缩窄高血压药物组、肾动脉缩窄高血压组的Cygb显著低于正常对照组，颈动脉中膜厚度显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；肾动脉缩窄高血压药物组的Cygb显著高于肾动脉缩窄高血压组，而颈动脉中膜厚度显著低于肾动脉缩窄高血压组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 比较三组大鼠颈动脉Cygb与中膜厚度指标

3 讨 论

Cygb研究热点主要集中在细胞纤维化与抑制癌组织浸润转移方面，研究发现Cygb具有以下功能：清除体内活性氧而减少氧化应激反应对细胞、组织的损伤[3]；抑制肿瘤，Cygb位于染色体17q25，在恶性肿瘤中经常丢失[4]； Cygb启动子甲基化使Cygb表达沉默，而肿瘤中Cygb启动子甲基化明显高于正常组织[5]。近年来，Cygb与心血管疾病的关系逐渐引起人们的关注。有研究发现Cygb主要在VSMCs表达，而血管内膜未发现表达信号。Cygb主要可能参与血管平滑肌中的NO代谢[6]。NO产生速率和代谢速率决定了VSMCs内NO浓度， Cygb具有NOD 的作用。Cygb在正常有氧的环境下，Cygb代谢NO的速率较快[7]。当体内器官或组织缺氧时， Cygb的mRNA和蛋白水平上调，NO代谢速率减慢使NO浓度增高，导致血管扩张[8]。研究发现，Cygb基因敲除小鼠血管壁内NO代谢降低75%，证实VSMCs中NO代谢部分依赖于Cygb[9]。Cygb调控VSMCs中NO浓度， b5R(cytochrome b5 reductase, b5R)是重要的珠红蛋白还原酶，敲除b5R NO代谢明显下降，提示VSMCs内NO浓度调控b5R介导有关。Cygb通过NO代谢途径调控内皮依赖性血管舒张与血管张力，成为VSMCs功能的调控因子。

血管紧张素II(Ang-II)通过不同的细胞内信号转导途径，释放活性氧，激活血管炎症反应，导致VSMCs发生表型转变。早先研究证实Ang-II参与VSMCs过氧化物(superoxide)正向合成增加，通过过氧化物介导的NO代谢过程致血管功能受损[10]。近来的研究发现Cygb能够矫正Ang-II诱导的高血压发生或逆转高血压病理过程。有研究分别对野生小鼠与Cygb基因敲除小鼠采用Ang-II诱发高血压模型实验，发现Ang-II对Cygb基因敲除小鼠不能成功诱发高血压，高度提示Cygb表达下调NOD进而调节NO具有预防高血压或逆转高血压的潜在作用[11]。研究发现Cygb-/-肠系膜动脉壁NO是野生小鼠的3.2倍。Ang-II介导NO代谢是继发于过氧化物而发挥作用的，而Cygb介导NO代谢减低补偿过氧化物介导的NO代谢增强避免血管功能受损[12]。Cygb参与矫正Ang-II诱导的高血压发生或逆转高血压病理过程，为高血压的防治提供了潜在的治疗思路。(本文图1见封三)