HPLC法测定福建金线莲中水仙苷的含量

张嘉嘉，陈 涛，鲍 文，许 文，徐 伟，林 羽，张 勋

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

金线莲为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰［Anoectochilus roburghii（Wal1.）Lindl］的干燥 全草，主要分布在我国的福建、浙江、广西、云南等地区，主要用于治疗高血压、糖尿病、心脏病、肺炎、急慢性肝炎、肾炎等疾病［1-2］。金线莲主要成分为黄酮、金线莲苷、多糖、核苷，其中黄酮类被认为是金线莲的重要有效成分，具有抗癌、保肝、抗菌、降血糖、抗氧化等多种功效［3-5］。《福建省中药材标准2006年版》［6］《福建省中药饮片炮制规范2012年版》［7］和《安徽省中药饮片炮制规范2005年版》［8］收载药用金线莲药材及饮片，检查项目包括水分、灰分、显微鉴别和薄层鉴别，无含量测定项。已有文献报道金线莲中含有芦丁、水仙苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素和异槲皮苷等6种黄酮［9］，其中水仙苷的含量最高，因此，本文以水仙苷为指标，建立高效液相色谱法（HPLC）测定福建金线莲水仙苷的含量，考察方法耐用性和可靠性，以期为金线莲质量标准提升提供科学依据。

1 材 料

1.1 仪器 Agilent 1290高效液相色谱仪、G4212A 1290 DAD检测器（美国安捷伦公司）；DF-15台式连续投料粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；AR-224CN电子天平、EX225DZH电子天平（奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500DE型医院数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MILLI-Q Direct16一体化超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药 水仙苷（中国食品药品检定研究院，批号：111997-201501）；色谱乙腈（默克化工技术有限公司）；色谱甲酸（上海麦克林生化科技有限公司）；色谱甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；实验用水皆为实验室自制二次蒸馏水；金线莲药材30批（经福建中医药大学药学院黄泽豪副教授鉴别，均为金线莲），详细信息见表1。

表1 金线莲样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性 色谱柱：Uitimate®HPLC AQ-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸（20∶80）；流速：1.0mL／min；检测波长：360 nm；柱温：30℃；进样量10μL。各峰与邻峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按水仙苷计算应不低于6000。空白溶剂、对照品及样品的色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备 取水仙苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL中含水仙苷0.1 mg溶液，摇匀，置4℃冰箱中备用。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取本品粉末（过4号筛）0.5g，精密加入80%甲醇25mL，称定重量，超声提取20 min（功率为350W，频率50 Hz），放冷，称重，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，静置，滤过，即得。

图1 空白溶剂、对照品及样品色谱图

2.4 线性关系 取对照品储备液，逐级稀释为7.494、10.71、15.29、21.85、31.21、44.59μg／mL的对照品溶液，进样10μL，测定峰面积。以水仙苷的浓度（μg／mL）为横坐标（X），以水仙苷色谱峰峰面积积分值（mAU）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得水仙苷线性回归方程：Y＝9.1401X－20.554，相关系数r＝0.9995，表明水仙苷在7.494～44.59μg／mL浓度范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 加样回收率 精密称取金线莲样品（20171202-2）0.5g，分别按对照品：药材含量（1∶0.5，1∶1，1∶1.5）的比例加入一定量的对照品，平行制备3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算水仙苷的回收率及其RSD。结果，加样回收率为97.62%～103.90%，RSD＜3.0%，表明该方法回收率良好。

2.6 精密度实验

2.6.1 精密度 精密称取同一批金线莲样品（批号20171202-2）1份，1 d内连续进样6次测定日内精密度，连续测定3 d，每天进样3针测定日间精密度。日内精密度RSD为0.7597%，日间精密度RSD为0.8703%，表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性实验 取批号为20171202-2的金线莲样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下测定水仙苷的峰面积，计算含量均值与RSD，RSD均小于3%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.3 重复性试验 精密称取同一批金线莲样品（批号20171202-2）6份，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定水仙苷的峰面积，RSD为0.688%，结果表明方法的重复性良好。

2.7 耐用性考察

2.7.1 改变分析仪器 取同一批金线莲样品（批号20171202-2），按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱方法，以不同品牌的色谱仪：Agilent 1260（检测器：1260DADVL）和Waters e2695（检测器：Waters 2998）2种高效液相色谱系统进行进样测定，RSD分别为0.7597%、0.6782%，表明本方法精密度良好，本色谱条件在一定色谱仪变动情况下耐用。

2.7.2 改变色谱柱 取同一批金线莲样品（批号20171202-2），按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下以不同品牌的色谱柱：月旭XB-C18、Agilent SB-C18、Waters HSS T3进样测定，RSD分别为0.193%、0.461%、0.868%，表明本色谱条件在一定色谱柱变动情况下耐用。

2.7.3 改变流动相pH 取同一批金线莲样品（批号20171202-2），按“2.3”项下方法制备供试品溶液。在不同流动相甲酸体积分数（纯水、0.10%、0.2%）下，按“2.1”项下测定水仙苷的含量，RSD分别为1.856%、0.193%、0.875%，表明本色谱条件在一定流动相pH值变动情况下耐用。

2.7.4 改变色谱流速 取同一批金线莲样品（批号20171202-2），按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件以不同流速（0.25、0.30、0.35mL／min）进样测定。结果水仙苷含量平均值为1.780mg／mL，RSD为0.15%，表明本色谱条件在一定流速变动情况下耐用。

2.7.5 改变柱温 取同一批金线莲样品（批号20171202-2），按“2.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件以不同柱温（25、30、35℃）进样测定。结果水仙苷含量平均值为1.777mg／mL，RSD为0.39%，表明本色谱条件在一定柱温变动情况下耐用。

2.8 含量测定 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定各批次金线莲样品，计算金线莲药材中水仙苷的含量，结果见表2。

3 讨论

本实验先后考察了不同提取溶剂（60%、70%、80%、90%、100%甲醇和60%、70%、80%、90%、100%乙醇）、不同提取时间（15、20、30 min）、不同提取温度（常温、30℃、40℃、50℃）、不同提取溶剂用量（20、25、30、35、40、45mL），发现80%甲醇25mL超声提取20 min水仙苷提取率最高。

表2 各批次金线莲测定结果（n＝3）

本文建立一种简便、实用的HPLC法分析金线莲药材水仙苷的含量。该方法专属性和耐用性强，简便可靠，可以为金线莲质量标准的提升研究提供参考依据。