原花青素对铁超载大鼠脑内二价矿物质元素、氧化应激及CREB、GLUT-1基因表达的影响

云少君 何兴帅 褚东阳 张文芳 冯翠萍 (山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801)

铁(Fe)对于大脑功能的发挥至关重要〔1,2〕。然而，Fe超载(IO)所诱导的氧化应激却极易影响脑组织，脑IO是许多神经退行性病变的共同病理变化〔3〕。老年人群由于生理特征极易发生脑内Fe的蓄积〔4〕。

Fe失衡会影响其他金属的代谢。此外，胰岛素信号及机体糖代谢亦受到Fe的影响〔5〕。研究表明，去Fe治疗可以增加胰岛素受体的表达，增进其与胰岛素的结合，同时上调某些参与葡萄糖摄取的基因，而葡萄糖转运蛋白(GLUT)-1是血脑屏障上存在的最有效的转运系统之一〔6,7〕。环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB)参与维持糖稳态和胰岛β细胞功能，具有改善神经系统等方面的作用〔8,9〕，其同时受到神经细胞氧化应激的影响〔10〕。因此，大脑Fe稳态的维持是至关重要的。目前对抗ID所用的去Fe胺等螯合剂均会出现不同程度的副反应，因此，许多天然产物越来越受到人们的重视。在黑茶和红酒中普遍存在的原花青素(PAs)具有广泛的生物、药理和化学保护特性，可抑制自由基生成，提高抗氧化酶活性，有效地螯合金属〔11，12〕。前期的研究也表明，葡萄籽原花青素(GSPAs)能抑制大豆种子铁蛋白中Fe的吸收〔13〕。本研究拟通过构建IO大鼠，并通过给予GSPAs的干预，探讨其对脑内Fe及其他二价矿物元素的影响，分析其对脑内氧化应激状态的影响，最后从糖代谢相关的GLUT-1、CREB基因的表达变化分析GSPAs对IO所引起脑损伤的改善作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 GSPAs(天津尖峰有限责任公司)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RNAiso Plus、SYBR® Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒、PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒、Loading Buffer(大连TaKaRa公司)；DNA Marker(武汉华美生物工程公司)；PCR引物〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕；焦碳酸二乙酯(DEPC，上海基康生物技术有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器 主要有 电感耦合等离子体质谱仪〔iCAP-Q，赛默飞世尔科技(中国)有限公司〕、核酸蛋白分析仪(BioPhotometer plus，德国Eppendorf公司)、琼脂糖凝胶电泳仪(DYCP-31CN型，北京六一生物科技有限公司)、实时荧光定量PCR仪(Mx3000P，美国Stratagene公司)。

1.3动物处理 8周龄SPF级雄性SD大鼠(由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，随机分为：NC 组、IO组、GSPAs 组、Test 组各10只。参照文献〔14〕，IO组和Test组隔天腹腔注射100 mg/(kg·bw)右旋糖酐Fe，GSPAs组和Test组每天灌胃100 mg/(kg·bw)的GSPAs，以生理盐水消除应激性误差。10 d试验期结束后，取大鼠脑组织保存于-80℃。

1.4脑组织Fe、Ca、Zn、Mg、Cu的测定 参照文献〔15〕，通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行检测。

1.5脑组织GSH-Px、CAT的测定 参照相应试剂盒说明书进行检测。

1.6qRT-PCR检测 CREB及GLUT1基因表达的测定 参照文献〔15〕，进行qRT-PCR实验。PCR扩增条件为：95℃ 5 min；95℃ 10 s、60℃ 30 s(45 cycles)；95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s。引物序列(5′>3′)为：β-actin上游：TACCCAGGCATTGCTGACAG；下游：AGCCACCAATCCACACAGAG。CREB上游：CCCCAGCACTTCCTACACAG；下游：CCCCAGCACTTCCTACACAG。GLUT-1上游：GCTGTGGCTGGCTTCTCTAA；下游：CCGGAAGCGATCTC-ATCGAA。

1.7统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，并以Turkey法进行均数间的两两比较。

2 结 果

2.1脑组织Fe、Ca、Zn、Mg、Cu的含量 与NC组比较，IO组Fe、Ca含量显著升高，Zn含量显著降低(均P<0.05)；GSPAs组Zn、Mg含量显著升高(均P<0.05)；Test组Ca含量显著升高(P<0.05)；与IO组比较，GSPAs组Fe、Ca显著降低，Zn、Mg显著升高(P<0.05)，Test组Fe含量显著降低(P<0.05)；各组Cu含量均无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.2脑组织抗氧化活性的影响 与NC组比较，IO组脑中GSH-Px、CAT活性明显降低(均P<0.05)；GSPAs组GSH-Px活性显著升高(P<0.05)。与IO组比较，GSPAs组、Test组GSH-Px、CAT活性均明显升高(均P<0.05)。见表2。

表2 各组脑组织中GSH-Px、CAT的活性

2.3脑海马组织CREB、GLUT-1 mRNA表达量的影响 与NC组比较，IO组海马CREB、GLUT-1 mRNA表达量明显下降(均P<0.05)；GSPAs组中CREB、GLUT-1 mRNA表达量明显升高(均P<0.05)。与IO组比较，GSPAs组Test组中CREB、GLUT-1 mRNA表达量均明显升高(均P<0.05)。见表3。

表3 各组脑海马中CREB、GLUT-1 mRNA表达量

3 讨 论

金属元素对于细胞内稳态的维持至关重要，过量补充Fe会导致机体IO。L型Ca通道可以在Fe过量情况下吸收Fe2+〔16〕。本研究推测脑组织过多的Fe诱导了Ca通道的开放和Ca的内流，导致Ca累积在细胞内引起组织中的Ca含量增高。IO导致Zn的下降，二价金属转运体(DMT)-1可以摄取非转Fe蛋白结合Fe，同时具有广泛的底物结合特异性，有利于Fe2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Cd2+,Cu2+,Ni2+和Pb2+的结合〔17〕。本研究中过量的Fe可能首先占据DMT-1，因此导致体内Zn2+吸收减少，从而导致脑组织Zn含量降低。GSPAs可以通过3∶1的比例与Fe结合〔12〕，而先前的研究也表明GSPAs可以抑制大豆种子Fe蛋白在大鼠体内的Fe吸收〔13〕，因此本研究推测GSPAs会影响Fe的吸收而减少其在脑组织中的沉积，从而对抗Ca、Zn、Mg的代谢失衡。本研究与上述结果相一致，即GSPAs通过螯合作用影响了Fe和Ca的摄取，进而影响了Zn、Mg的含量。

Fe负荷会导致组织氧化损伤，而GSPAs具有非常强的抗氧化活性〔18〕。本研究结果说明GSPAs通过影响抗氧化酶对抗IO所诱导的氧化应激。

研究表明，Fe代谢与葡萄糖代谢具有双向的调节关系，过多的Fe沉积会干扰葡萄糖代谢而引起高胰岛素血症；而另一方面高胰岛素血症则会通过增加细胞外Fe的摄入，转Fe蛋白受体的重分布及下调Fe调素引起Fe的沉积〔19～21〕。GLUT-1能够介导葡萄糖顺浓度梯度进入胞质内〔7〕。CREB与机体糖代谢亦密切相关〔22〕。本试验中过量的Fe可能通过氧化应激进而干扰胰岛素信号，最终影响GLUT-1及CREB的表达，而GSPAs能够螯合过量的Fe，并改善氧化应激状态，从而通过上调GLUT-1及CREB的表达改善细胞的糖代谢，其调控机制有待后续深入研究。