miR-210通过NF-κB信号通路影响宫颈癌Hela细胞恶性生物学行为

罗茹蓉 张桂芸 姚文香 雒钰花 吴梅仙 (白银市第二人民医院妇科，甘肃 白银 730900)

宫颈癌(CC)是世界上最常见的妇科恶性肿瘤之一，也是女性癌症相关死亡率的主要原因〔1〕。在过去几十年中，随着CC组织的病理检查的改善和早期诊断的应用，CC的发病率和死亡率显著降低，但晚期出现转移的宫颈癌患者5年生存率仅5%～15%〔2〕。目前，CC的主要治疗方法是手术、化疗和放疗，尽管目前人们在治疗和预防方面付出了巨大努力，但患者预后仍不能令人满意。因此，充分了解CC的发生和发展的机制，对识别和筛选CC早期诊断和临床治疗的分子标志物具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类内源性小的非编码RNA，长度18～22个核苷酸，其与相关靶mRNA的3′-UTR相互作用，通过直接和间接影响mRNA的转录过程来调节相关基因的表达。近年来，据报道miRNA在一些参与肿瘤发生的事件中起重要作用，如细胞存活、增殖、凋亡、侵袭和转移〔3，4〕。研究表明，miR-210在人类不同的肿瘤中发挥致癌的作用，如结肠直肠癌、乳腺癌和膀胱癌等〔5～7〕。据报道，miR-210能够促进前列腺癌细胞上皮间质转化和骨转移，该过程与核因子(NF)-κB信号通路密切相关〔8〕。然而，miR-210在CC细胞恶性生物学行为中的作用仍然未知。本实验通过检测miR-210在CC细胞中的表达，探究其对Hela细胞恶性生物学行为的影响及可能的机制，以期为CC的早期诊断和靶向治疗提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1材料 人正常宫颈上皮细胞H8和CC细胞Hela、caski、siha和c4-1均购自美国ATCC细胞库；胰蛋白酶和DMEM培养基均购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；青霉素、链霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；miR-210 inhibitor及inhibitor Control购自广州市锐博生物科技有限公司；TRIzol试剂和Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitogen公司；逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链式反应(PCR)测定试剂盒和AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡测定试剂盒购自日本TaKaRa公司；噻唑蓝(MTT)试剂和二甲基亚砜均购自美国Sigma公司；Transwell小室购自美国Coring公司；细胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、电化学发光(ECL)试剂购自碧云天生物科技研究所；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关x蛋白(Bax)和酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2细胞培养和转染 人宫颈癌Hela细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，在培养基中分别加入终浓度为1×105U/L的青霉素和100 mg/L的链霉素，将细胞放置在含5%CO2、相对湿度95%、37℃培养箱中培养，细胞贴壁生长密度达80%以上时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。将对数生长期的Hela细胞接种到6孔板中，每孔接种2×105个细胞，置培养箱常规培养，细胞达50%～60%融合时，根据Lipofectamine 2000试剂说明书转染miR-210 inhibitor或inhibitor Control，将细胞分为空白对照(Control)组、阴性对照(anti-NC)组和实验(anti-miR-210)组，各组Hela细胞置37℃培养箱继续培养。

1.3qRT-PCR检测细胞中miR-210的表达水平 分别收集处于对数生长期的H8、Hela、caski、siha、c4-1细胞和转染48 h后各组Hela细胞，TRIzol法提取各细胞中总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用荧光定量PCR试剂盒进行扩增，反应条件为：94℃ 3 min，94℃ 15 s，56℃ 20 s，72℃ 10 s，共40个循环。以U6为内参，采用相对定量2-△△Ct法计算miR-210相对表达水平。

1.4CCK-8法检测Hela细胞增殖情况 对数期的Hela细胞接种到96孔板中，细胞接种密度为5×103个/孔，待细胞贴壁生长后按照1.2进行转染，每组细胞设置3个复孔，在转染48 h时，向每孔细胞中缓慢加入10 μl CCK-8溶液，避免气泡产生，在37℃培养箱孵育4 h，使用酶标仪测定波长为450 nm处光密度值(OD值)，实验重复3次。

1.5Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力 Hela细胞转染48 h后，用不含血清的DMEM培养液饥饿处理16 h，分别收集各组细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，每个Transwell小室的上室(侵袭实验Transwell小室的上室预先用Matrigel胶包被，迁移实验Transwell小室的上室不以Matrigel胶包被)加入100 μl细胞悬液，在下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液，置37℃培养箱继续培养48 h。取出Transwell小室，用90%乙醇固定20 min，用0.1%结晶紫染色20 min，用棉签擦去上室未穿膜的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，风干，在显微镜低倍镜(×100)下随机选取5个视野进行观察，并记录细胞数，实验重复3次。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡情况 分别收集转染48 h后各组Hela细胞，用预冷PBS洗涤细胞2次，离心收集约1×106个细胞，加入结合缓冲液100 μl重悬细胞，向细胞悬液中加入FITC-AnnexinⅤ溶液5 μl，轻轻混匀，孵育15 min，再向细胞中加入PI染液5 μl，混匀后避光反应15 min，使用上流式细胞仪检测各组Hela细胞凋亡情况，实验重复3次。

1.7Western印迹检测蛋白表达水平 转染48 h后收集各组Hela细胞，加入适量细胞裂解液，置冰上提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白样品浓度，取30 μg蛋白样品行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后电转至PVDF膜上，在含5%脱脂奶粉的封闭液中封阻1 h，分别加入一抗4℃过夜杂交，Bcl-2一抗(1∶500)，Bax一抗(1∶500)，酶切Caspase-3一抗(1∶500)，IκBα一抗(1∶500)，p-IκBα一抗(1∶500)，NF-κB一抗(1∶500)，p-NF-κB一抗(1∶500)。PBST洗涤3次(每次10 min)，加入HRP标记的二抗(1∶2 000)，室温杂交2 h。PBST洗涤3次(每次10 min)，以ECL试剂显影，以β-actin标定，采用Image J软件分析条带灰度值。

1.8统计学方法 使用SPSS21.0软件进行单因素方差分析及SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-210在CC细胞中表达水平升高 qRT-PCR检测结果显示，Hela细胞(3.52±0.38)、caski细胞(2.44±0.25)、siha细胞(2.59±0.28)和c4-1细胞中miR-210的表达水平(1.94±0.20)显著高于正常宫颈上皮H8细胞(1.00±0.10，P<0.05)。在Hela细胞中的表达水平最高，后续采用Hela细胞开展功能实验。

2.2miR-210 inhibitor转染效率检测 anti-miR-210组Hela细胞中miR-210表达水平(0.31±0.03)明显低于Control组(1.00±0.11)和anti-NC组(1.00±0.09，P<0.05)。Control组和anti-NC组细胞中miR-210表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3敲减miR-210抑制Hela细胞增殖、侵袭和迁移能力 CCK-8实验结果显示，anti-miR-210组Hela细胞OD值明显低于Control组和anti-NC组(P<0.05)。Control组和anti-NC组细胞OD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Transwell实验结果显示，anti-miR-210组侵袭和迁移细胞数明显低于Control组和anti-NC组(P<0.05)。Control组和anti-NC组侵袭和迁移细胞数相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1和表1。

图1 敲减miR-210对Hela细胞侵袭和迁移能力的影响(结晶紫染色，×200)

表1 敲减miR-210对Hela细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

2.4敲减miR-210促进Hela细胞凋亡 流式细胞仪检测结果显示，anti-miR-210组Hela细胞凋亡率明显高于Control组和anti-NC组(P<0.05)。Control组和anti-NC组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。Western印迹检测凋亡相关蛋白结果显示，anti-miR-210组Hela细胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表达水平明显高于Control组和anti-NC组(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平明显低于Control组和anti-NC组(P<0.05)。Control组和anti-NC组细胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表2和图3。

图2 流式细胞仪检测各组Hela细胞凋亡率

组别凋亡率(%)Bcl-2Bax酶切Caspase-3Control组5.31±0.680.76±0.080.11±0.010.04±0.01anti-NC组5.42±0.660.74±0.070.10±0.010.03±0.01anti-miR-210组19.26±2.111)2)0.30±0.031)2)0.52±0.061)2)0.68±0.071)2)F/P值108.267/0.00049.869/0.000136.026/0.000244.765/0.000

图3 Western印迹检测各组Hela细胞中Bcl-2、Bax和酶切Caspase-3蛋白表达水平

2.5敲减miR-210抑制NF-κB信号通路的激活 Western印迹检测结果显示，anti-miR-210组Hela细胞中p-IκBα和p-NF-κB蛋白表达水平明显低于Control组和anti-NC组(P<0.05)，IκBα和NF-κB蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)；Control组和anti-NC组细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4和表3。

图4 Western印迹检测各组Hela细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平

表3 各组Hela细胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平比较

3 讨 论

研究发现，miRNA表达异常不仅能够调控肿瘤细胞无限增殖还可影响细胞侵袭和转移〔9，10〕。因此，深入探究miRNA的生物学功能为恶性肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供新的方向。以往研究显示，miR-210在人类多种肿瘤中呈高表达，作为致癌基因，miR-210能够靶向调控基因表达或信号通路的活化。如Liu等〔11〕研究发现，miR-210在骨肉瘤组织中的表达显著高于其配对正常组织，体外功能实验结果显示，miR-210可通过直接靶向成纤维细胞生长因子受体样(FGFRL)1促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭。Luan等〔12〕研究显示，miR-210通过靶向Bcl-2腺病毒E1B相互作用蛋白(BNIP)3保护肾上腺嗜铬细胞瘤PC-12细胞免受缺氧诱导的损伤，此外该过程涉及PI3K/AKT/mTOR信号通路。阳宁等〔13〕研究发现，miR-210在前列腺癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，其可通过下调BNIP3的表达抑制前列腺癌PC-3细胞凋亡。并且miR-210的表达升高与肾癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等肿瘤淋巴结转移、TNM分期和预后不良有关〔14～16〕。目前研究发现，miR-210在宫颈癌组织中异常高表达，然而关于miR-210在宫颈癌中的功能及作用机制尚不清楚〔17〕。

有研究指出，miR-210作为致癌基因可通过上调Bax、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达水平促进胶质瘤U87细胞的凋亡〔18〕。另一项研究表明，miR-210可通过调控Bcl-2和Bax蛋白表达水平影响卵巢癌OVCAR3和SKOV3细胞凋亡〔19〕。本研究结果显示，敲减miR-210后细胞中Bax和酶切Caspase-3蛋白表达水平明显上调，Bcl-2蛋白表达水平明显下调，这与以往研究一致。提示敲减miR-210可能通过调控凋亡相关蛋白表达水平促进细胞凋亡。研究表明，NF-κB信号通路在人类多种类型的癌症中异常激活，这与肿瘤的进展和转移显著相关。例如，在CC中，NF-κB信号的异常激活与CC的预后不良密切相关；抑制NF-κB信号通路能够抑制CC细胞增殖、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡〔20～22〕。在静息的细胞中，NF-κB和IκB结合形成复合体，以无活性形式存在于细胞质中，当细胞受外界刺激后，IκB发生磷酸化暴露NF-κB核定位位点，NF-κB转位至细胞核，进而调控相关基因转录及表达〔23〕。本研究结果提示过表达miR-210可能抑制NF-κB信号通路的激活。Zhang等〔24〕研究发现，miR-210通过靶向死亡受体(DR)6抑制NF-κB信号通路影响软骨细胞活力和细胞凋亡。结合Zhang等〔24〕和Ren等〔8〕研究提示miR-210可能通过调控NF-κB信号通路发挥作用。本研究结果表明miR-210可能通过调控NF-κB信号通路影响CC Hela细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移。

总之，本研究结果表明miR-210在CC细胞中呈高表达，敲减CC Hela细胞中miR-210的表达能够通过抑制NF-κB信号通路的激活抑制细胞增殖、侵袭和迁移，诱导细胞凋亡。提示miR-210可能有望成为CC靶向治疗的新靶点。