mTOR、Beclin1和LC3在非黑色素瘤性皮肤肿瘤中的表达

魏姗姗 严卿文 闫璐 邱贤文 赖宽 肖莎 米向斌

(南方医科大学 1珠江医院皮肤科，广东 广州 510280;2阳春市妇幼保健院皮肤科；3南方医院皮肤科；4珠江医院病理科)

皮肤鳞状细胞癌(SCC)、基底细胞癌(BCC)和脂溢性角化(SK)统称为非黑色素瘤性皮肤肿瘤(NMSC)，是起源于表皮或皮肤附属器的肿瘤〔1〕，发展速度较缓慢，绝大部分仅出现局部破坏性病变。SCC和BCC的治疗方法多样，包括手术、物理、药物和放射治疗等，但仍有一定的局限性，比如复发率、手术切除后形成的瘢痕或畸形影响美观〔2〕。SK是临床最常见的皮肤良性肿瘤，病因不明，与紫外线照射及日光性损伤密切相关。SCC、BCC和SK三者均好发于中老年人，病理均表现为上皮细胞增生异常。皮肤肿瘤的形成机制与其他肿瘤类似，可能与肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、血管生成及细胞黏附等密切相关。随着人口老龄化和检测手段的进展，全球NMSC的发病率每年增加3%～8%〔3〕，针对其发病机制的研究变得尤为重要。

自噬是真核生物特有的溶酶体介导的分解代谢过程，分为巨自噬、分子伴侣介导的自噬和微自噬三种。目前巨自噬研究较清楚，也是本文重点研究的对象，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)/B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)/Beclin1通路、三磷酸肌醇(IP3)和细胞内Ca2+都可以调控巨自噬的活性〔4〕。Ki-67是一种核蛋白质，由Mki-67基因编码，是细胞增殖的重要标志物，常可作为预测恶性肿瘤发展及预后的指标。自噬与多种肿瘤的发生、发展密切相关，有望成为肿瘤治疗的新方向。然而自噬在皮肤肿瘤中的研究较少，本文拟初步探讨mTOR、Beclin1和微管相关蛋白轻链(LC)3在NMSC中的表达及意义。

1 材料及方法

1.1一般资料 SK组、BCC组和SCC组标本各27例，来自2017年1月至2019年1月在南方医科大学珠江医院和南方医科大学南方医院就诊的患者，病例均行苏木素-伊红(HE)染色及免疫组化确诊，临床及病理资料完整。正常对照(Normal)组15例，取自皮肤科活检手术切除的部分正常皮肤。各组年龄及性别分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组年龄和性别分布比较

1.2主要试剂 兔源mTOR、LC3、Beclin1抗体均购自美国 Abcam公司。免疫组化试剂盒〔封闭液、二抗及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂〕 购自武汉博士德生物有限公司。

1.3免疫组化及结果判定 SK、BCC、SCC组织白片来自医院病理科，正常皮肤组织石蜡包埋后行4 μm连续切片。全部切片常规脱蜡入水，修复抗原，3%H2O2除去内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，4 ℃孵育一抗(mTOR、Beclin1、LC3)过夜。第2天依次室温孵育二抗、DAB显色，苏木素复染，最后脱水透明后烘干封片。由至少两名病理科诊断医师对免疫组织化学染色切片进行评估。在显微镜下观察SCC、BCC和SK细胞和正常表皮着色情况，积分数=阳性染色细胞百分比评分×染色强度评分。阳性染色细胞百分比判定标准：每个标本都随机选择5个高倍视野(×200)，每个高倍视野计数100个细胞，计算出每个视野中阳性细胞比的平均数。<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。染色强度判定标准：无着色或呈与背景均匀一致的淡黄色为0分；浅棕黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性等级：0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(+)；5～8分为阳性(++)；9～12为强阳性(+++)。

Ki-67免疫组化由两位病理科医师单独判读后取平均。Ki-67阳性标准：细胞核内出现棕黄色颗粒染色。先在5倍镜下随机选取病损区域结构良好、背景清晰的5个区域，随后随机观察5个200倍视野，每个视野计数100个细胞，计算出阳性细胞的所占比例即为Ki-67的百分比。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prim 7.0软件进行t检验、单因素方差分析、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各组mTOR的表达 mTOR在SK、BCC和SCC组中的表达均高于Normal组，差异有统计学意义(P<0.05)；mTOR在SCC组中的表达显著高于BCC组(P<0.05)；mTOR在BCC组中的表达显著高于SK组(P<0.05)。见表2。mTOR在正常皮肤标本中绝大多数呈弱阳性表达(图1)。

图1 各组中mTOR的表达

2.2各组Beclin1的表达 自噬相关基因Beclin1在正常皮肤标本中绝大多数呈阳性或强阳性表达(图2)。Beclin1在BCC和SCC组中表达均显著低于Normal组(P<0.05)，在SK组中的表达低于Normal组，但差别无统计学意义(P>0.05)；Beclin1在SK组中的表达显著高于BCC组(P<0.05)；Beclin1在BCC组中的表达显著高于SCC组(P<0.05)。见表2。

图2 各组中Beclin1的表达

2.3各组中LC3的表达 LC3在正常皮肤标本中绝大多数呈阳性或强阳性表达(图3)。LC3在SK、BCC和SCC组中表达均显著低于Normal组(P<0.05)；LC3在SK组中的表达显著高于BCC组(P<0.05) ；LC3在BCC组中的表达显著高于SCC组(P<0.05)。见表2。

图3 各组中LC3的表达

表2 各组mTOR、Beclin1、LC3的相对表达比较

2.4各指标间相关性分析 mTOR相对表达值与Beclin1、LC3表达值呈负相关(r=-0.486、-0.381，均P<0.01)，Beclin1相对表达值与LC3呈正相关(r=0.884,P<0.01)。

2.5Ki-67在BCC和SCC中的百分率 Ki-67在BCC、SCC组中阳性表达率分别为27.00%±12%、37.48%±10%，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

自噬是一种高度保守的细胞内成分降解过程，具有维持细胞结构和功能稳定的重要作用。在不同的疾病状态下，细胞自噬具有不同的作用，比如清除损伤作用的细胞因子、直接诱导损伤细胞死亡、甚至可能降解正常细胞结构〔5〕。自噬相关基因启动子、调节转录因子，蛋白激酶等多种因子的激活都可以调控细胞自噬的活性。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/VPS30的同源基因，在自噬的发生、发展过程中有着重要作用。此外，Beclin1是自噬体形成的一个必需因子，它可介导其他自噬蛋白定位于自噬而调控自噬体的形成与成熟。酶母Atg8基因(在哺乳动物中的同系物是LC3)家族蛋白是细胞自噬形成过程中重要的适配器蛋白，与细胞自噬过程中的许多关键步骤相关，比如自噬体的形成、成熟等。

mTOR是细胞内一类丝/苏氨酸蛋白激酶，属于雷帕霉素的作用靶点，是细胞生长、新陈代谢、衰老的中心控制器。mTOR有mTORC1和mTORC2两种不同的复合体。mTORC1可通过磷酸化核糖体S6激酶调控蛋白质的合成，或通过真核起始因子4E结合蛋白1促进转录而对细胞生长、新陈代谢等产生影响〔6〕。mTOR信号通路存在于各种细胞中，参与细胞生长、增殖和分化调节，与肿瘤的发生、发展密切相关。既往的研究表明mTORC1通路在基底细胞癌中高表达，而且针对mTOR的靶向药物对进展期基底细胞癌有治疗作用〔7,8〕。Zeng等〔9〕研究显示咖啡酸正丁酯可通过抑制丝氨酸-苏氨酶激酶(Akt)/mTOR从而引起皮肤癌细胞株(A431细胞)的凋亡。此外，Akt/mTOR的抑制剂LY3023414在皮肤癌细胞株(A431细胞)的体内、体外研究显示:在皮肤癌中Akt/mTOR通路被异常激活，而LY3023414可以抑制皮肤癌Akt/mTOR的激活和癌细胞的生长〔10〕。本研究结果显示，mTOR在SCC、BCC和SK中表达均高于正常皮肤组织，与相关研究〔7～10〕结论相似。

自噬是维持细胞存活、分化和生长所必须的溶酶体降解途径，与多种肿瘤细胞的恶性转化和细胞生长密切相关。mTOR通路与巨自噬密切相关，可通过以下途径调控巨自噬的活性：①在营养丰富的条件下，mTOR可通过直接磷酸化和Unc-51样自噬激酶(ULK)1蛋白去稳定化而对ULK1负性调节；②当营养物质下降时，mTOR失活，此时ULK1可磷酸化AMBRA1和苄氯素(BECN)1，进而激活VPS34，最终导致来自内质网(ER)的自噬体的成熟，启动自噬；③下降的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)Ⅰ(Ⅰ级PI3K)/Akt可间接失活mTOR而诱发巨自噬〔11〕；④mTOR通路可通过抑癌基因，比如p53、人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)和结节硬化(TSC)2等，调控自噬的活性〔12〕。既往的研究表明，在肝细胞癌中mTOR通路被异常激活而导致细胞凋亡和自噬抑制〔13〕。在银屑病中，不同蛋白相互作用可通过激活mTORC1而抑制自噬的活性从而促进银屑病的发生和发展〔14〕。在皮肤癌中关于自噬机制的研究鲜为少见。Thongrakard等〔15〕研究表明皮肤癌细胞株(A431细胞)的巨自噬活性较正常组下降。本研究发现SCC、BCC和SK中自噬活性指标Beclin 1、LC3表达下降，mTOR异常增高；且LC3与Beclin 1的表达呈正相关，LC3与mTOR表达呈负相关。Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核抗原，是评价肿瘤细胞增殖程度最可靠的指标之一。与BCC相比，SCC组织中Ki-67高表达，提示肿瘤细胞增殖活跃，侵袭力强，易发生转移，预后较差，与临床表现一致。在SCC组织中Ki-67和mTOR均高表达，提示两者可能共同促进肿瘤的发生，且两者表达越高可能预示肿瘤恶性程度更高、侵袭力更强，易发生转移，有希望成为判断SCC预后的有力指标。

综上所述，NMSC的发病可能与mTOR/Beclin 1/LC3信号通路密切相关，而且mTOR与NMSC的恶性程度呈正相关，同时自噬与NMSC的恶性程度呈负相关性。因此，降低mTOR从而调控自噬的活性，可能对NMSC发生、发展起到重要的作用。