利用SSR标记构建部分山楂资源的基因身份证

张 枭，杜 潇，孙馨宇，王 键，董文轩

（1.沈阳农业大学园艺学院，沈阳110161；2.通化市园艺研究所，吉林通化134001）

山楂属植物（CrataegusL.）为蔷薇科中一个较古老的属，广泛分布于北半球温带。20 世纪中期，山楂属植物的分组相关研究中，将山楂属植物分为25个组[1]。我国原产的山楂属植物通常认为是6个组，包括18个种和6个变种[2]，经过长期的选择，形成了丰富的种质资源。传统山楂属植物的种类划分基于形态特征和地理分布，广泛存在于山楂属植物中的无融合生殖、种间杂交以及多倍化等现象导致其形态学特征发生高度遗传变异[2]，同时也造成山楂资源中普遍存在的同物异名和同名异物现象，给山楂属植物的种类划分及资源鉴定带来了较大困难。开展山楂种质资源的特异性识别技术探索，准确鉴定山楂资源的特异性，可为资源的保存与合理利用提供理论基础。传统的形态学等资源鉴定方法易受环境条件、生长状态、发育时期等因素的影响，且需要鉴定者具备较为专业素养，耗时费力。利用分子标记鉴定资源，则可避免以上因素，且操作简便、快速、稳定[3]。SSR 标记作为共显性分子标记技术，具有多态性高、稳定性和重复性好、实验操作简单等优点[4]。近年来，已广泛应用于葡萄[5]、澳洲坚果[6]等果树种间杂种的鉴定；柑橘[7]、枣树[8]等多倍体果树资源的发掘与鉴定。国际植物品种保护联盟（UPOV）于2007 年已将SSR 标记确定为植物新品种保护最广泛应用的分子标记体系之一[9]。分子身份证在SSR 指纹图谱的基础上，基于一定原则对SSR 指纹进行字符编码，获得可快速、准确区分不同种质资源的字符串。基于SSR 标记的分子身份证研究在山茶[10]、苦荞[11]、萝卜[12]、百合[13]、水稻[14]、及果树种质资源包括桃[15]、苹果[16]、葡萄[17]和梨[18]上已有相关报道。SSR 标记在山楂属植物的种类划分中已有研究[19-20]。与RAPD和ISSR 相比，SSR 标记在山楂基因型遗传变异与种间关系的研究中更具优势[21]。XU 等[22]利用二代测序技术对山楂进行高通量测序，获得了大量的SSR 信息。DU 等[23]选取山楂转录测序数据中200 对SSR 引物，筛选得到40 对具有多态性的SSR 引物，用于探索我国原产7 个山楂种的种间关系。劳永春[24]利用12 对多态性好的SSR引物鉴定了39 份山楂存疑资源。上述研究均表明SSR 标记可有效用于山楂资源鉴定及遗传多样性分析。目前山楂种质资源尚未制定资源鉴定标准。本研究利用SSR 标记对国家果树种质沈阳山楂圃内48 份山楂种质资源进行分子条形码开发，旨在为资源圃内山楂属植物的鉴定和保护，及国内外山楂种质资源收集、保存与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于2018 年4 月下旬在国家果树种质沈阳山楂圃内采集48 份山楂属资源。其中10 份伏山楂（C.Brettschneideri）资源包括来自吉林省的吉伏1号、吉伏2号、左伏1号、左伏2号、财红、555和82015；辽宁省的沈农伏山楂1号、伏里红和辽宁大果。4份毛山楂（C.Maximowiczii）资源包括来自黑龙江省的毛山楂1号、毛山楂2号、毛山楂3号和苏4。4份来自辽宁省的辽宁山楂（C.Sanguinea）1号、2号、3号和4号。9份羽裂山楂（C.Pinnatifida）资源包括来自内蒙古自治区的野生山里红1号、山西省的野生山里红2号、山东省的野生山里红3号和野生山里红4 号、黑龙江省的野生山里红6 号及辽宁省的野生山里红5 号、野生山里红7 号、野生山里红8 号和野生山里红9 号。12 份羽裂山楂大果变种（C.Pinnatifidavar.）资源包括来自辽宁省的清原磨盘、开原软籽、辽红、黄果山楂和秋金星；山东省的费县大棉球、蒙阴大金星、白瓤绵和益都敞口；河北省的雾灵紫肉；北京市的京短1号；吉林省的大旺山楂。6份湖北山楂（C.Hupehesis）包括来自湖北省的湖北山楂1号、湖北山楂2号和湖北山楂3 号；山东省的泰安实生、宪平砧木和牧狐梨。2 份来自云南省的云南山楂（C.Scabrifolia）1 号和2 号。每份资源采集3棵山楂树的新鲜、幼嫩叶芽，液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 试材DNA的提取 参考李媛媛[25]的方法，选取山楂幼嫩叶片采用改良的CTAB 法提取总DNA。改良的步骤包括将预热的CTAB 提取缓冲液加入0.2%巯基乙醇；加入500μL 的氯仿/异戊醇（24∶1）抽提2 次，加入480μL 预冷的无水乙醇混匀-20℃静置30min；使用RNase（10μg·μL-1）混匀水浴后，加入3mol·L-1NaAc（pH =5.2）；100μL DNA，-20℃保存于1∶10 的TE 溶液中。用琼脂糖电泳检测DNA 条带（琼脂糖浓度1%，点样体积2μL，电泳电压100 V，应用1×TBE 电泳缓冲液），NanoDrop 2000 检测DNA 浓度（取DNA 10μL 稀释100 倍，点样体积1μL，测定DNA样品的分光光度值D260nm和D280nm，并计算D260nm/D280nm比值和DNA浓度。将每份样品DNA稀释至20～30ng·L-1，保存于-20℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增反应与聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR 扩增选用DU 等[23]研究中多态性好的14 对SSR 引物，引物信息见表1。PCR 反应体系20μL，包含1μL DNA 模板，7μL 2× Es MasterMix buffer，2μL 正反向引物，10μL超纯去离子水。PCR 扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56～59℃退火1min，72℃延伸1min，30 个循环；72℃延伸7min，4℃保存。Thermal Cycler（Applied Biosystems，美国）中进行PCR扩增。PCR产物点入含6%聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TBE buffer中进行电泳检测，电泳后银染法显色，灯箱下观察，记录SSR扩增条带。

表1 本试验中所用SSR引物Table 1 SSR primers used in this study

1.2.3 遗传多样性及聚类分析 将所得电泳图进行读带，根据扩增片段大小依次读取，有带记“1”，无带记“0”，形成“0-1”矩阵。使用Popgene 32 计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon 信息指数（Shannon’s information index，I）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、遗传分化系数（Fst）；Cervus 计算多态信息含量（polymorphism information content，PIC）。使用NTsys 2.10e 计算相似系数，利用SAHN 模块的非加权组平均法（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Means，UPGMA）绘制48份山楂资源的聚类分析树状图。

1.2.4 数据的处理和二维码的转换 获得原始数据的第1 位点、第2 位点、第3 位点、第4 位点参考刘冠群等[10]文中编码原则进行数据转换，获得每个引物扩增条带的相应编码数字。根据本试验中引物顺序，将所有引物对应的编码数字及字母串联成字符串，于在线条码生成器（http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode128b.php）生成条形码及二维码图像，所得条形码为该资源的条形码DNA分子身份证。

2 结果与分析

2.1 山楂资源SSR标记多态性分析

以山楂属中48份资源的DNA模板为扩增对象，利用14对SSR引物进行PCR反应扩增，获得各引物多态性条带。每对引物扩增出等位基因数2～4 个。有效等位基因数（Ne）变幅为1.176（C60）至1.969（C40），均值1.680；Shannon’s 多样性指数 I 变幅为0.283（C60）至0.686（C66），均值0.582；多态信息含量（PIC）变幅 0.139（C60）至0.372（C66），均值0.311（表2）。本试验中，遗传分化系数Fst 范围从0.057（C4）至0.742（C66），均值0.447，说明48份山楂资源种间存在较大的遗传分化。

2.2 基于SSR标记的聚类分析

14对SSR引物获得等位基因频率计算资源间的相似系数为0.290～0.968。48份山楂资源中。山东的益都敞口与辽宁的清原磨盘及北京的京短1 号相似系数最大（0.968）；辽宁的辽红与黑龙江的毛山楂2 号的相似系数最小（0.290）。

聚类分析结果（图1）表明，14对SSR引物可将48份资源区分为2组，其中属于伏山楂、羽裂山楂、羽裂山楂大果变种、湖北山楂和云南山楂的资源为组Ⅰ。来自辽宁、山东、河北和吉林羽裂山楂大果变种资源与湖北山楂1 号、2 号聚为其中一分支；来自内蒙古的野生山里红1 号、山西的野生山里红2 号、黑龙江的野生山里红6号、辽宁的野生山里红9号与云南山楂的1号、2号聚为其中一分支；辽宁与吉林的伏山楂资源与山东的野生山里红3 号和牧狐梨及辽宁的野生山里红5 号、7 号聚为其中一分支。毛山楂和辽宁山楂资源分为组Ⅱ：毛山楂1～3号、宁安山楂、苏4与辽宁山楂1～3号聚为一支，亲缘关系较近，且与其他种山楂资源亲缘关系较远。

利用Popgene 32 软件基于Nei's 遗传距离构建的UPGMA 聚类分析山楂属资源种属差异（图2）。7 个山楂种之间，羽裂山楂与伏山楂亲缘关系最近，距离为2.388；湖北山楂与羽裂山楂大果变种的距离较近，为2.406；云南山楂与伏山楂及羽裂山楂距离较近（“4”到“1”的距离为4.468）。毛山楂与辽宁山楂的亲缘关系最近，为2.406，这两个种与其他种山楂亲缘关系较远（“6”到“5”的距离为17.641；“6”到“3”的距离为20.703）。

表2 14对SSR引物在48份山楂资源中多态性扩增结果Table 2 Amplification information of 14 pairs of SSR primers in 48 Crataegus resources

图1 48份山楂资源UPGMA聚类分析树状图Figure 1 Dendrogram of 48 Crataegus resources using UPGMA cluster analysis

2.3 山楂资源分子身份证的构建

分子身份证代码构建的方法参考刘冠群等[10]的方法。14 对SSR 引物扩增48 份山楂资源的电泳条带结果进行人工读带，将同一引物扩增出的条带按大小依次排序统计。根据位点的等位基因的差异，标记为A/A、B/B、C/C、D/D 等基因型，根据表3的原则进行编码，并按14对引物顺序建立数据矩阵。表2分析结果中等位基因数为2或4，因此编码范围为1～9及A、B。其中无等位基因编码为“B”，即表3中“其他”。。当SSR引物扩增出2个等位基因，条带数据统计为“1，0”时记为“A/A”；“0，1”时记为“B/B”；“1，1”时记为“A、B”，存在4种类型；当SR引物扩增出4个等位基因，存在11种类型（表3）。

图2 山楂资源不同种群分析树状图Figure 2 Dendrogram of Crataegus population based Nei's genetic distance using UPGMA method

14 对引物形成的分子身份证共14 位数字及字母，每份资源仅有唯一的分子身份证号。将对应的数字串编码输入在线条码生成器，选取Code-128模式生成供扫描的分子身份证条形码。编码结果及分子身份证条形码详见表4。

表3 不同基因型的编号Table 3 Code of different genotypes

3 讨论与结论

分子身份证可给与种质资源唯一的标识，用于区分品种，操作快速便捷[15]。建立分子身份证，将DNA 指纹图片进行数字化转换，更便于种质资源的检索及识别[26]。农业农村部颁布了关于植物品种鉴定DNA 分子标记法（NY/T 2594-2016）、玉米品种鉴定SSR 标记法（NY/T 1432-2014）、水稻品种鉴定SSR 标记法（NY/T 1433-2014），苹果品种鉴定规程SSR分子标记发（NY/T 2478-2013），柑橘属品种鉴定SSR分子标记法（NY/T 3436-2019），枣品种鉴定技术规程SSR 分子标记法（NY/T 2426-2015），江苏省梨品种DNA 指纹图谱鉴别规范（DB32/T 2089-2012）和河北省葡萄品种DNA 指纹鉴定方法（DB13/T 1567-2012）等标准。这些标准可为SSR法鉴定山楂种质资源提供有效参考。

构建分子身份证的编码方式主要包含以下类型：将每对引物扩增的条带按从小到大排列，依次编码，有两个等位基因时取其中碱基数较少的一个[15]；将SSR图谱结果的“0-1”字符串由二进制转化为十进制编码[27]；将获得一系列带型用数字进行编码，按照固定引物顺序，串联各带型编码，形成一组数据，即该品种的分子身份证[28]。本研究中利用14对已验证过多态性的SSR 标记[23]，为每一个位点的带型数据进行编码。14对引物在48份山楂资源中，每对引物扩增出的等位基因数为2～4 个，有效等位基因数（Ne）变幅1.176～1.969，均值1.680；多态信息含量（PIC）变幅0.139～0.372，均值0.311。编码时，采用1～9 及A、B 共11 个字符对等位基因进行编码，每一对引物在分子身份证上对应一位字符，串联构成山楂资源的DNA条形码。

山楂资源植物学特征的鉴定评价受外界环境影响比较大。描述山楂资源的鉴定评价与新品种特异性、一致性、稳定性基于《山楂资源的鉴定农作物种质资源鉴定评价技术规范山楂（NY/T 2325-2013）》和DUS 测试。DUS 测试要求更加严格，所选测试材料为1～3 年无性繁殖的植株，且至少在测试地点定植2 年以上，测试周期为1～2个生长周期。目前将分子身份证引入DUS测试，完善测试内容，提高测试效率已成为新发展趋势[29]。本研究构建了48 份山楂资源的分子身份证，并将其生成分子条形码，条形码的数字串可以被具有扫码功能机器解读，快速地识别不同山楂资源身份信息。同时，构建山楂种质资源分子身份证数据信息库，为每份资源设立独立分子身份证，可提高山楂资源鉴定、评价与利用效率。

随着山楂资源的不断收集和鉴定，可能产生本研究中不包含的带型。根据刘峰等[30]可鉴别区分的最大品种数的计算公式为N=G1×…×Gn，理论上所选用的14 对引物最多可以区分214 份山楂资源，基本可以满足种质

资源鉴定的需求。但14对引物有可能无法区分部分资源。因此在今后山楂资源分子身份证库的建立过程中，可增加多态信息含量高、区分资源能力强的SSR标记，或结合其他类型的分子标记进行资源鉴定。

表4 48份山楂资源的条形码DNA分子身份证Table 4 DNA molecular identify cards of 48 Crataegus resources

本研究利用14 对SSR 分子标记，区分来源于不同省份的48 份山楂种质资源，并在建立SSR 指纹图谱基础上编码获得分子身份号，形成每份山楂资源的可供快速识别的条形码即分子身份证，为鉴定和保护山楂种质资源收集、保存与利用提供理论依据。