山西老陈醋大曲细菌群落结构及多样性研究

张天震，孙晓琪，刘丹彤，王宏霞，王超敏，王如福，许 女

（山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801）

大曲是山西酒、醋酿造中重要的发酵剂，在山西酒、醋的发酵过程中起着非常重要的作用，直接影响产品质量和产量。大曲中的微生物利用原料底物生成大量不同种类的香味物质或香味前体物，再经过微生物的转化及工序传递，赋予成品酒、醋丰富的滋味和良好的香气，构成传统山西酒、醋特有的风味。

大曲中的微生物种群主要包括霉菌、酵母菌和细菌3 大类。霉菌是大曲中最主要的菌群，其代谢产生丰富的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等酶系，用于分解淀粉和蛋白质原料产生多种有机酸、氨基酸、酯类等风味物质。酵母菌不仅利用糖生成大量乙醇和其它醇类物质，同时还生成乳酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多种酯类香气物质。大曲中的细菌则主要包括芽孢菌、乳酸菌和少量醋酸菌，众多种类的细菌大大补充并丰富了霉菌的酶系，是产生有机酸、酯类、酮类、醛类等风味物质[1]和酚、黄酮、乙偶姻等功能活性物质的主要贡献者[2]。

近年来，一些学者对山西老陈醋大曲中的微生物进行了分离。武晋海等[3]采用传统分离手段从陈醋大曲中分离到乳酸菌、芽孢菌和醋酸菌，并且发现醋酸菌主要分布在大曲表面，乳酸菌和芽孢菌则主要分布在大区内部。冯峰[4]采用传统分离手段结合PCR-DGGE 技术研究大曲制备过程，发现前期的优势菌主要为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）及融合魏斯氏菌（Weissella confusa），中期优势菌主要为欧文氏菌（Erwinia sp.）；后期则主要是芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

本文采用高通量测序技术研究山西老陈醋酿造用大曲的细菌群落多样性，为揭示山西老陈醋微生物酿造机理，进一步优化大曲生产工艺，提高大曲质量奠定基础。该研究对于整个老陈醋行业的发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在山西老陈醋东湖醋厂曲房中随机选取3 块大曲置于灭菌的自封袋中，粉碎后混合保存于-80℃冰箱，备用。

1.2 主要试剂与设备

1.2.1 试剂QIAquick PCR Purification Kit，德国Qiagen 公司；Tris-平衡酚，北京索莱宝科技有限公司；乙二胺四乙酸钠，天津市恒兴试剂有限公司。

1.2.2 设备170-4406 型水平电泳系统、Universial HoodⅡ型凝胶成像系统、T100 型PCR 仪，美国Bio-Rad 公司；5417R 型高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；anoDrop2000 型微量紫外-可见光分光光度计，美国Thermo Scientific 公司。

1.3 宏基因组提取

参考聂志强等[5]提取醋醅宏基因组的方法。提取的宏基因组用微量紫外-可见光分光光度计进行检测，OD260/280值维持在1.8～2.0 范围内，表明宏基因组质量合格，可用于后续测序。

1.4 细菌DNA 片段扩增及Miseq 文库建立

以提取的宏基因组DNA 为模板，加入细菌对应区域特异性引物（515F：5’-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3’和806R：5’-GGACTACHVGGG TWTCTAA-3’）、PCR MasterMix 对细菌16S rDNA V4 区域进行扩增，扩增产物送至深圳华大基因进行文库构建及测序，测序平台为MiSeq 2000。

1.5 系统发育进化树构建

将测序得到的操作分类单元（OTU）序列在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）采用基本局部比对搜索工具（Basic local alignment search tool，BLAST）进行比对，搜索与目的OTU 序列同源性最高的序列，经MEGA 5.1 软件构建系统发育进化树。

2 结果与讨论

2.1 山西老陈醋大曲细菌群落多样性分析

以山西老陈醋大曲宏基因组DNA 为模板，利用特异性引物对细菌16S rDNA V4 区域进行扩增，采用MiSeq 2000 测序平台进行测序。由表1可知，大曲样品获得36 995 个原始读长，滤除低质量的数据后，剩余35 116 个高质量读长。利用重叠关系将双末端测序得到的成对读长拼接成32 230 个序列，平均长度为（252 ±1）bp。拼接好的序列聚类为104 个细菌OTU。最终，测序覆盖度达到99.93%，说明该测序量合理，可以进行下一步分析。

表1 山西老陈醋大曲细菌OTU 划分情况Table 1 The OTU information of the bacterial communities in the Daqu of Shanxi aged vinegar

α-多样性通常用于分析单个样本中微生物数量的丰度及微生物种类的多样性，主要包括Chao指数、ACE 指数、Shannon 指数和Simpson 指数。通过Mothur（v1.31.2）软件计算微生物群落α-多样性指数期望值并用R（v3.1.1）软件绘制相应的细菌α-多样性稀释曲线。由图1可知，测序量在10 000 bp 以内时，随着测序量增加，山西老陈醋大曲细菌的Chao 指数和ACE 指数急剧增加，当测序量增加到25 000 bp 之后，Chao 指数、ACE 指数、Shannon 指数和Simpson 指数都趋于平缓。

图1 山西老陈醋大曲细菌α-多样性稀释曲线Fig.1 Alpha divisty curves of bacterial communities in the Daqu of Shanxi aged vinegar

2.2 大曲细菌群落结构分析

将OTU 序列在NCBI 网站进行BLAST 比对分析，采用MEGA 5.1 软件构建系统发育进化树。从图2和图3结果可以看出：山西老陈醋大曲中共检测到4 个细菌门，分别是厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），其中厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，分别占69.67%和29.17%，放线菌门及拟杆菌门仅占0.86%和0.28%。

如图2所示，厚壁菌门上仅检测到杆菌纲（Bacilli），包括的菌属主要是：乳杆菌属（Lactobacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、片球菌属（Pediococcus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）、明串珠菌属（Leuconostoc）和科克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia），相对丰度分别为32.82%，29.45%，2.13%，1.65%，1.01%，0.65%和0.09%。

乳酸菌是大曲和食醋酿造过程中的主要优势细菌[6]，其代谢产生的乳酸等不挥发性酸可以降低食醋中醋酸的刺激性气味，改善食醋风味，赋予山西老陈醋绵酸醇柔的特点。另外，乳酸菌除产酸外，还可以产生细菌素等抑菌物质，在整个酿造过程中起到抑制杂菌、净化、保持、改善酿醋微生态环境的作用。乳酸菌产生的γ-氨基丁酸（GABA）是近年来揭示的传统谷物醋中重要功能成分之一。

图2表明山西老陈醋大曲中的乳酸菌菌群主要是乳杆菌属。其中，OTU3 与瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）B1-3 相似度达99%。高亦豹等[7]在江苏白酒大曲中也检测到瑞士乳杆菌。李岩等[8]则从永春老醋发酵过程样品中筛选出具有较高耐酸性的瑞士乳杆菌YCL-5，并将其应用于葡萄醋的静置液态发酵中，用于改善葡萄醋的发酵风味。OTU33 与短乳杆菌（Lactobacillus brevis）SKB1023 相似度达99%。相似地，刘雄等[9]和吴林寰[10]在酿醋大曲和镇江香醋发酵过程中也检测到短乳杆菌的存在，并推测短乳杆菌可能是食醋重要功能活性成分——川芎嗪的前体乙偶姻的主要产生菌株。OTU10 与耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）OJC01 相似度为99%，此菌种最初是由Entani 等[11]在米醋酿造过程中检测到的，该菌能够以葡萄糖、果糖、甘露糖等多种碳源为底物进行发酵，代谢产物主要为醋酸和乳酸。张荣展等[12]采用PCR-DGGE 法也证实了耐酸乳杆菌在天津独流老醋酿造中的存在，由于其具有较强的耐酸性，因此是发酵后期的优势菌群。OTU15 与桥乳杆菌（Lactobacillus pontis）HBUAS52247 同源性达99%。桥乳杆菌最初是在开菲尔粒中被发现[13]，是典型的异型乳酸发酵菌株，能发酵己糖产生乳酸、乙醇和二氧化碳。姚粟等[14]和高亦豹等[7]分别在芝麻香型白酒大曲和江苏白酒大曲中检测到桥乳杆菌。桥乳杆菌也在发酵酸面团[15]和发酵豆乳清[16]等其它发酵食品中被检测到。

除乳杆菌属外，魏斯氏菌属、片球菌属和明串珠菌属也是乳酸菌的重要菌属。OTU53 和OTU2分别与绿色魏斯氏菌（Weissella viridescens）FB077 和融合魏斯氏菌HBUAS54389 相似度最高（100%）。魏斯氏菌属具有很强的产β-葡糖苷酶的能力，能够参与发酵底物中纤维素的降解[17]，另外，具有产乳酸、产胞外多糖、产抑菌物质等特性，近年来在食品发酵工业中开始受到关注。与本文研究结果相似，Nie 等[18]利用PCR-DGGE 技术在山西老陈醋大曲和酒醪中检测到绿色魏斯氏菌和融合魏斯氏菌。孙峰宇[19]则从食醋酒醅中分离纯化到1 株微小魏斯氏菌（W.minor），并将其与酵母菌进行协同醋酸发酵，最终使醋醅中的乳酸含量提高了2.10 倍，柠檬酸含量提高了4.5 倍，酯类含量提高了10%，有效改善了液态酿造食醋的风味。OTU11 与乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）C1-36-L4a 相似性达100%。L ü等[20]和叶光斌等[21]在泸州老窖高温大曲和武夷红曲糯米酒发酵液中也检测到了乳酸片球菌。本文还检测到假肠膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）的存在。明串珠菌属是典型的异型乳酸发酵菌株，能发酵糖类产生多种酸和醇，还能代谢柠檬酸产生风味成分双乙酰[22]，具有抗氧化和拮抗致病菌等能力，常用于发酵乳制品、泡菜和果酒中。刘芸雅等[23]对绍兴黄酒麦曲的研究发现，明串珠菌属在麦曲制备后期逐渐增加，并和乳杆菌属协同分泌乳酸，从而为酵母菌的生长繁殖提供适宜的酸性环境。焦玉双等[24]将假肠膜明串珠菌L18 强化应用在老陈醋发酵中，最终使新淋醋中不挥发酸含量得到显著提高。

图2结果显示，OTU97 与OTU4 分别与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SXKF16-5 和HYM25 相似度达到99%，OTU7 和OTU23 则与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）KW55P和SS1 的相似度达99%和100%。研究表明，解淀粉芽孢杆菌为酱香型白酒大曲中的优势细菌，在大曲制备过程中人为接种地衣芽孢杆菌后，显著提升了大曲的淀粉酶活性和酱香型大曲典型风味物质——己酸乙酯的含量。另外，吴林寰[10]采用宏基因测序揭示芽孢杆菌能以己糖为碳源生成乙偶姻，乙偶姻累积到一定程度后与重要中间代谢产物异硫氰酸酯（C5H9NS）反应，环化、脱羧、脱硫后可生成食醋重要功能活性成分——川芎嗪，故芽孢杆菌是提升食醋营养功能价值的重要菌种。

高温放线菌（Thermoactinomyces sp.）具有明显的嗜高温特性，常见于自然界的高温场所，如堆肥、稻草、蔗渣等，具有产细胞溶解酶、嗜热淀粉酶和新普鲁兰的功能，是研究嗜热酶的重要微生物[14]。近年来，一些学者相继从多种类型大曲中发现了高温放线菌的存在。叶光斌等[21]通过构建泸州老窖高温大曲细菌16S rRNA 基因克隆文库，检测到普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）及高温放线菌。相似地，葛媛媛等[25]也从芝麻香型白酒大曲中分离到1 株普通高温放线菌，研究证实其具有嗜高温、产碱性磷酸盐酶、酯酶、类酯酶等特性。本文首次在山西老陈醋大曲中检测到高温放线菌，关于其在食醋大曲和酿造中的作用机制及开发利用尚待进一步研究。

OTU28 与血液克罗彭斯特菌（Kroppenstedtia sanguinis）X0394 相似性达100%。姚粟等[14]采用构建16S rDNA 克隆文库的方法研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落，发现克罗彭斯特菌是大曲中的第2 优势菌属，其发现的象牙色克罗彭斯特菌（Kroppenstedtia eburnea）属首次报道，目前尚未有关于其功能的研究报导。刘延波等[26]利用高通量测序技术在浓香型白酒大曲中也检测到克罗彭斯特菌（Kroppenstedtia），并证实此菌种由于不耐高温，在大曲制备后期丰度显著下降。

非厚壁菌门细菌系统发育树如图3所示，变形菌门的γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），检测到的菌属包括泛菌属（Pantoea）和不动杆菌属（Acinetobacter），分别占27.36%和0.80%。

泛菌属是常见的植物内生菌，具有很强的固氮活性和促生作用，能以木质素为碳源，代谢生成醇类物质，其次级代谢产物具有广谱抗菌活性[27]。本文检测到的泛菌属的菌种主要是成团泛菌（Pantoea agglomerans，OTU5）、彩花泛菌（Pantoea anthophila，OTU49）和布氏泛菌（Pantoea cypripedii，OTU59），可能来源于制曲的原料大麦或豌豆中。泛菌属产生的抑菌活性物质可能在长达21 d 的制曲和3～6 个月的大曲成熟和储存期间起着抑制杂菌的作用。Li 等[28]研究发现，泛菌属具有编码β-葡萄糖苷酶的基因，除分解底物中的纤维素类物质外，还参与形成烯萜类化合物，可赋予食醋果香及酯香等风味。另外，成团泛菌还能发酵D-葡萄糖和其它糖类产生有机酸，提升食醋中不挥发性酸的含量。

图2 基于16S rDNA 基因序列构建的山西老陈醋大曲细菌厚壁菌门系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequences of Firmicutes clone libraries from the Daqu of Shanxi aged vinegar

检测到的不动杆菌主要是约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii，OTU29）和不动杆菌（Acinetobacter sp.，OTU37 和OTU48）。王晓丹等[29]研究证实不动杆菌属是遵义地区酱香型大曲重要细菌类群之一，可分泌重要的生物活性物质，如抗生素、酶和维生素，还能产生磷脂和叶黄素[30]等功能活性物质。

放线菌门上主要检测到直杆糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula，OTU8 和OTU12）和霍尔迪糖多孢菌（Saccharopolyspora hordei，OTU38）。相似地Nie 等[18]和Li 等[28]也曾采用DGGE 技术在山西老陈醋大曲中检测到直杆糖多孢菌的存在，并证实此类菌属能代谢糖类生成挥发性脂肪酸。除食醋生产大曲外，白酒大曲中也有发现糖多孢菌属菌群的报道，研究表明其可产生抗肿瘤抗生素、多种酶类、酶抑制剂等多种生物活性物质[31]。

本文首次在食醋大曲中检测到北黄黄杆菌（Flavobacterium beibuense，OTU31）的存在。关于黄杆菌属，是1923年由Bergey 首次从海洋沉积物中分离并命名的[32]，目前已包含60 多种模式菌株，关于其在大曲中存在的作用和意义，今后需进一步进行研究。

3 结论

本文主要采用高通量测序技术揭示山西老陈醋大曲的细菌群落结构，证明厚壁菌门和变形菌门为优势菌门。芽孢菌属、乳杆菌属和泛菌属为主要的优势菌属，其中与瑞士乳杆菌、短乳杆菌、耐酸乳杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和成团泛菌等具有很高的相似性。菌群结构的揭示，为解析山西老陈醋微生物酿造机理、强化菌种制曲、大曲制备工艺革新等奠定了基础，对传统山西老陈醋的现代生物技术创新提升，产业转型、升级具有重要意义。